Micobacteriófagos reporteros para el diagnóstico rápido de TB y screening de nuevas drogas antituberculosas

URDÁNIZ, ESTEFANÍA; PAYASLIAN, FLORENCIA; DO PORTO, DARÍO F.; HATFULL, GRAHAM F.; RONDÓN, LILIANA; MATTEO, MARIO; TURJANSKI, ADRIAN G.; POGGI, SUSANA; LATINI, CECILIA; SOSA, EZEQUIEL J.; NEMIROVSKY, SERGIO; PIURI, MARIANA

Congreso; I Jornadas Latinoamericanas de Bacteriofagos; 2019

La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que alrededor del 40% de los casos de Tuberculosis (TB) no se diagnostican y, en consecuencia, no se tratan. En 2016, la OMS recomendó el uso de pruebas moleculares para acelerar el Testeo de Susceptibilidad a Antibióticos (TSA) a pesar del alto costo de equipamiento e insumos, aunque el método de preferencia para determinar viabilidad de los bacilos es todavía la tinción de Ziehl Neelsen de Mycobacterium spp. directamente en muestras de esputo, con el subsecuente cultivo y TSA usando el método de proporciones. Los fluofagos son micobacteriófagos reporteros que acarrean en su genoma genes fluorescentes. Estos fagos pueden utilizarse para evaluar de manera simple y rápida el estado metabólico de M. tuberculosis y su respuesta a antibióticos. La nueva construcción de fluofagos mCherry bomb posee alta sensibilidad para detectar en un tiempo corto células de M. tuberculosis. Hemos desarrollado una metodología simple basada en microscopía de fluorescencia para la detección de Mycobacterium spp. viable y la determinación fenotípica de la resistencia a rifampicina en 3-5 dias desde la toma de la muestra de esputo compatible con los protocolos de rutina en laboratorios clínicos donde se diagnostica TB. Una fijación con paraformaldehído permite reducir los riesgos biológicos. Se evaluó mCherry bomb φ para TSA extendido de aislamientos clínicos de cepas pre-XDR y XDR-TB y se comparó el perfil de resistencia a antibióticos con aquellos predichos por secuenciación de genoma completo enfatizando la utilidad de las pruebas fenotípicas para M. tuberculosis. Por otro lado, hemos puesto a punto las condiciones para infección de cultivos puros de M. tuberculosis en un formato multiwell en presencia de concentraciones crecientes de drogas monitoreando la aparición de señal fluorescente mediante el uso de un fluorímetro en función del tiempo. Se realizó el TSA completo en 6-30 horas (cuando se requería una pre-incubación con la droga) desde cultivo puro. La metodología desarrollada promete ser simple y de bajo costo para la rápida detección y determinación de resistencia a rifampicina de M. tuberculosis en muestras de esputo facilitando, de esta manera, la terapia y la propagación de cepas resistentes en locaciones de bajos recursos. Finalmente, el ensayo fenotípico automatizado para el TSA de cultivos puros en un tiempo corto permitirá llevar a cabo un método rápido, sencillo y altamente sensible para screening de alto rendimiento de nuevas drogas anti-TB.