Análisis y caracterización de la lisina A del bacteriófago TM4 como un potencial enzibiótico ÓN DE LA LISINA A DEL BACTERIÓFAGO TM4 COMO UN POTENCIAL ENZIBIÓTICO

MARTÍN, MARIANO; PAYASLIAN, FLORENCIA; MARTÍ, MARCELO; URDÁNIZ, ESTEFANÍA; PIURI, MARIANA

Congreso; I Jornadas Latinoamericanas de Bacteriofagos; 2019

La tuberculosis en una enfermedad infecciosa causada por Mycobacterium tuberculosis. A pesar de ser tratable la aparición de cepas multiresistentes presenta un gran desafío para su control. Una alternativa prometedora a los antibióticos es la fagoterapia o el uso de proteínas derivadas de fagos que pueden ser usadas como enzibióticos. El micobacteriófago TM4 tiene un amplio rango de huésped e infecta a numerosas micobacterias, incluyendo M. smegmatis y M. tuberculosis. TM4 codifica en su genoma para dos proteínas con actividad lítica: Gp29, que fue identificada in silico como lisina A (LysA), con actividad putativa como N-acetilmuramoil-L-alanina amidasa; y Gp30, con actividad putativa como esterasa de ácidos micólicos.El objetivo de este estudio es la caracterización del mecanismo de acción de LysA sobre el peptidoglicano (PG) y su actividad lítica tanto desde dentro como fuera de la bacteria. Se realizó un análisis bioinformático para confirmar la presencia de dominios, que ya habían sido descriptos como peptidasa, amidasa y de reconocimiento de peptidoglicano. Luego, por el uso de PDBSum y PFAM se determinaron los aminoácidos involucrados en la reacción en las posiciones E290, H226, H335 y D347.La actividad de LysA desde adentro de la bacteria fue ensayada en M. smegmatis. Para esto, la secuencia que codifica para LysA se clonó en un plásmido bajo un promotor inducible. Un cultivo de M. smegmatis mc2155transformada con esta construcción se indujo y luego se permeabilizó con cloroformo para permitir el acceso de la proteína al peptidoglicano a través de la membrana plasmática. Luego de 10 horas se observó una disminución de la densidad óptica en presencia de cloroformo. Luego, para evaluar la actividad in vitro de LysA, se realizó un zimograma usando Micrococcus lysodeikticus ATCC 4698 (0.2% m/v) como sustrato; la actividad lítica se evidencia por la aparición de un halo incoloro. Por este método se evaluó tanto la actividad de la proteína wild-type como de las mutantes E290Q, H226S, H335S y D347N. Se detectó actividad enzimática para la proteína wild-type, pero no así para las mutantes, indicando que las mismas son defectivas para la lisis. Para evaluar si estas mutaciones afectan la capacidad lítica del fago, LysA fue reemplazada por sus versiones mutadas E290Q o H226S en el fásmido phAE81, derivado de TM4, utilizando la técnica de BRED (Bacteriophage Recombineering of Electroporated DNA). Los fagos que contienen dichas mutaciones pueden replicar y completar el ciclo lítico cuando se plaquean en top agar conteniendo M. smegmatis mc2155. En resumen, estos resultados confirman que LysA puede degradar la pared de peptidoglicano tanto in vivo como in vitro y fue posible identificar al menos cuatro residuos claves del sitio catalítico. Sin embargo, la capacidad lítica del fago no se vio afectada por las mutaciones en LysA, indicando que esta enzima no es esencial para la liberación de la progenie o que existe al menos otra lisina A en el genoma de TM4 que aún no ha sido descripta.