Estudio de la actividad chaperona in vitro de la phasina PhbP de Pseudomonas extremaustralis

MEZZINA MARIELA P; ALVAREZ DANIELA S; PETTINARI JULIA M; WETZLER, DIANA E

Rosario, Santa Fé

Congreso; XXIII Congreso Latinoamericano de Microbiología, XIV Congreso Argentino de Microbiología 2016; 2016

ALAM

Las phasinas son proteínas asociadas a los gránulos intracitoplasmáticos de polihidroxialcanoatos (PHA), un conjunto de polímeros biodegradables producidos por muchos géneros bacterianos. Además de su función estructural y regulatoria en la acumulación de polímero, nuevas funciones han sido atribuidas a estas proteínas. Tal es el caso de la phasina PhaP de Azotobacter sp. FA8 (PhaPAz), para la cual se observó un efecto protector inesperado ante el estrés térmico y oxidativo en cepas de E. coli no productoras de PHA. Se demostró que dicha protección ante el estrés se basa en la capacidad de PhaPAz de actuar como chaperona molecular, evitando la agregación de proteínas mal plegadas. El objetivo de este trabajo fue analizar si la actividad chaperona descripta para PhaPAz es una propiedad extensiva a otras phasinas provenientes de distintos microorganismos. Para ello, se trabajó con la phasina PhbP de Pseudomonas extremaustralis (PhbPPe). En estudios preliminares se había determinado que la expresión heteróloga de phbPPe en E. coli también produce el efecto protector ante el choque térmico observado con PhaPAz. Análisis in silico de PhbPPe predicen que la estructura secundaria estaría formada por 4 α-hélices intercaladas entre regiones random coil y que presentaría regiones desestructuradas. Con el objetivo de obtener información experimental de la estructura y función de esta phasina, se construyó un plásmido que permite la producción de PhbPPe fusionada a un tag de seis histidinas en el extremo amino terminal. La proteína de fusión se purificó mediante cromatografía de afinidad sobre iones metálicos, utilizando una columna de níquel. Para obtener información de la estructura secundaria de la proteína realizaron experimentos de dicroísmo circular (CD), obteniéndose un 21% de sus aminoácidos en conformación α-hélice.Con el fin de estudiar si PhbPPe presenta actividad chaperona se realizaron experimentos de desnaturalización térmica utilizando la enzima citrato sintasa (CS). Para ello se agregó una concentración final de 0,15 μM de CS a soluciones precalentadas a 45 °C conteniendo distintas concentraciones de PhbPPe. La agregación espontánea de la CS a 45°C fue monitoreada midiendo la dispersión de la luz a 360nm en un espectrofotómetro con cubeta termostatizada. Los resultados demostraron que PhbPPe frena el proceso de agregación de esta enzima, a la vez que disminuye la cantidad final de agregados formados. Esto pone de manifiesto que PhbPPe posee actividad chaperona in vitro. Se realizó también una comparación de la actividad chaperona entre PhbPPe y PhaPAz, encontrándose que las mismas presentan actividades muy similares. En conjunto, los resultados obtenidos demuestran que la actividad de chaperona molecular no es una característica singular de PhaPAz sino que podría ser común entre las phasinas, y abren el camino a futuros estudios con phasinas de otros microorganismos para continuar generando evidencia a favor de esta hipótesis.