Células madre placentarias: caracterización, diferenciación hepática y evaluación experimental de su utilidad clínica

JULIETA LORENA MAYMÓ

Mar del Plata

Simposio; LX Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica; 2015

SAIC

La placenta reviste un gran interés como fuente de células para la medicina regenerativa, dada la plasticidad fenotípica de muchos de los tipos celulares aislados de este tejido. Más aún, al estar involucrada enel mantenimiento de la tolerancia fetal, contiene células con características inmunomoduladoras. Los tejidosplacentarios son fáciles de obtener, sin necesidad de procedimientos invasivos, proliferan rápidamente, se obtienen en gran masa y su uso no genera debates éticos. Publicaciones recientes indican que existen varios tipos de potenciales células madre derivadas de placenta humana, entre ellas, las células epiteliales del amnios (hAEC). Las hAECs expresan marcadores de células madre y poseen la capacidad de diferenciarse a los tres tipos de capas germinales. No expresan telomerasa y no son tumorigénicas. Estas propiedadesvuelven al amnios una fuente útil y no controversial de células para el trasplante y la medicina regenerativa. Los objetivosparticulares de nuestro trabajo son: 1-Caracterización de células epiteliales de membrana amniótica humana.2-Estudio de los mecanismos celulares involucrados en la diferenciación de las hAECs a células hepáticas, respecto a la proliferación celular y apoptosis. Estudio de los caminos de transducción de señales activados.3-Como aplicación clínica, el objetivo se centra en desarrollar, a partir de un modelo murino, una estrategia alternativa al trasplante de hígado en pacientes con patología hepática crónica que lo requiera. Las enfermedades hepáticas afectan a millones de personas en todo el mundo. Actualmente, la única terapia efectiva para los estadios finales de enfermedadeshepáticas, es el trasplante completo del órgano; procedimiento que implica altos costos, alta mortalidad y se encuentra extremadamente limitado por la escasez de donantes. La diferenciación de células madre a hepatocitos permitirá el estudio racional de mecanismos moleculares implicados en el desarrollo hepático y proveerá de una fuente renovable de hepatocitos exógenos para analizar la toxicidad de drogas y, principalmente, para las terapias celulares. Varios estudios apoyan la hipótesis de que el epitelio amniótico contiene células con características de células madre que podrían ser útiles para la regeneración de tejidos dañados. En el presente trabajo, hemos logrado el eficiente aislamiento y caracterización de las hAECs.Determinamos, por qRT-PCR, que estas células expresan niveles significativos de los marcadores de pluripotencia Sox-2, Oct-4 y Nanog, y que su expresión disminuye a medida que transcurren los días en cultivo. Determinamos también por microscopía de fluorescencia, que las hAECs expresan el marcador de células embrionarias SSEA-4. Estudiamos la expresión de Sox-2, Oct-4 y Nanog y de los marcadores hepáticos α-fetoproteína, α1AT, CYP7A1 y albúmina, durante 30 días de diferenciación hepática, inducida con factores específicos (EGF 10 ng/ml + Dexametasona 0,1µM) o con mediocondicionado (MC) de células HepG2.Observamos, por microscopía, el cambio en la morfología de las hAECs. Los marcadores de pluripotencia disminuyeron significativamente durante el proceso de diferenciación, mientras que los marcadoreshepáticos incrementaron su expresión, medida por qRT-PCR. Por Western blot,determinamos la expresión de albúmina ydel citocromo hepático CYP3A4, en las células en diferenciación. Al mismo tiempo, observamos un cambio en la morfología de las hAECs tratadas con factores específicos, adquiriendo características similares a las de hepatocitos en cultivo. Hemos comenzado a analizar también los procesos de proliferación y apoptosis durante la diferenciación hepática temprana y tardía de las hAECs. Determinamos por Western blot, un incremento -cuando se trató con MC- y una disminución -cuando se trató con EGF- en la fragmentación de caspasa-3, luego de 72 h de tratamiento. Observamos, a través de la incorporación de 3H-timidina, que elEGF indujo la proliferación de las hAECs, mientras que el MC la disminuyó. El mismo resultado obtuvimos cuando ensayamos la viabilidad de las hAECs en diferenciación, mediante el ensayo de MTT. El tratamiento con factores produjo un aumento significativo en la viabilidad de las hAECs, mientras que el MC la disminuyó. Las hAECs control se mantuvieron viables y proliferando durante todo el proceso de diferenciación ensayado. Mediante qRT-PCR, observamos un aumento en la expresión de los genes de p53 y p21 y una disminución en la expresiónde ciclina D1, cuando se trató con MC; el efecto opuesto se observó tratando con factores específicos. Elucidando los mecanismos moleculares y celulares mediante los cuales las hAECs alcanzan la diferenciación hepática, contribuiremos a mejorar y lograr mayor eficiencia de este proceso. Nuestros estudios sugieren que lashAECs son capaces de diferenciar exitosamente a hepatocitos, lo que representa un avance fundamental para su futura aplicación en las enfermedades hepáticas y la medicina regenerativa.