CONICET | Buscador de Institutos y Recursos Humanos

Lasobreexpresión de proteínas en E.colimediante ingeniería genética, en determinadas condiciones lleva a la formaciónde agregados intracelulares enriquecidos en la proteína heteróloga llamadoscuerpos de inclusión (CI). Dado su tamaño (1 µm de diámetro), los CI pueden ser aislados del resto del contenido celular por centrifugación. Si bienanteriormente se los ha considerados agregados de proteína desnaturalizada, ennuestro laboratorio demostramos que los CI de b-galactosidasarecombinante (CIβ-Gal) pueden catalizar la hidrólisis lactosa. Elobjetivo de este trabajo fue producir CIβ-Gal y evaluar latermoestabilidad funcional y su relación con el tamaño de los mismos. Paraobtener CIβ-Gal, el pellet proveniente de la centrifugación de bacteriaslisadas que sobreexpresaban β-Gal, se sometió a lavados con bufferfosfato/Tritón X-100 (50 mM) y luego buffer sin detergente, mediantecentrifugación a 10.000 rpm x 10 min. El sedimento final conteniendo los CIβ-Gal,conservados a 4°C y sometidos periódicamente a lavados con buffer fosfatomediante centrifugación, conservaron la actividad catalítica durante 6 meses. Losexperimentos de preincubación a diferentes temperaturas y posterior medición dela actividad en condiciones óptimas (37°C), mostraron que CIβ-Galpresenta mayor resistencia que la proteína soluble a la inactivación térmica.Por ejemplo: después de la preincubación a 50°C se recupera un 50% de actividadinicial (sin preincubación) en el caso de CIβ-Gal y un 30% en el de β-Galsoluble. Por otro lado, los sucesivos lavados inducen un aumento en el tamañomedio de los CIβ-Gal y un ensanchamiento de curva de distribucióncon un aumento en la frecuencia de partículas más pequeñas. Estos resultados reflejanlas perturbaciones inducidas por los lavados tanto sobre el equilibrio entrelos estados plegado (β-Galp)/desplegado(β-Gald) de la proteína ensolución y el equilibrio de distribución de β-Galp y de β-Galdentre el CIβ-Gal y la solución