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La beta-galactosidasa (beta-Gal) es una enzima que cataliza la hidrólisis de lactosa, el azúcar de la leche, en glucosa y galactosa. Ésta se encuentra localizada en las células epiteliales del intestino delgado y su ausencia o baja actividad produce intolerancia a la lactosa, enfermedad que se manifiesta con problemas gastrointestinales. Una forma de revertir estos efectos sería por medio del consumo de alimentos que contuvieran a la enzima en forma encapsulada e inactiva en el alimento, en la boca y en estómago pero que, al liberarse en el intestino, pudiera expresar su actividad. Esto genera la necesidad de diseñar sistemas de encapsulamiento y activación para lo cual es necesario conocer el comportamiento de la enzima en sistemas molecularmente superpoblados (SMS) como lo son los alimentos y el quimo, la masa de alimentos digeridos que se transporta por el tubo digestivo. Los SMS se caracterizan por poseer alta concentración de diferentes macromoléculas que en conjunto ocupan una importante fracción del volumen total. En estas condiciones, las moléculas son sometidas a restricciones estéricas y difusionales que afectan sus propiedades. La mayoría de las metodologías utilizadas para caracterizar la cinética de una enzima se basan en la utilización de métodos espectroscópicos que permiten visualizar un producto artificial coloreado de la reacción. Este tipo de cuantificaciones pueden resultar muy imprecisas si se utilizan SMS como sistemas de reacción. La calorimetría de titulación isotérmica (ITC, Isothermal Titration Calorimetry) mide el calor asociado con una reacción química. Las reacciones químicas ocurren con toma o liberación de calor; la velocidad de reacción es proporcional a este flujo de calor, siendo así cuantificable por ITC. Los objetivos del presente trabajo fueron: i) investigar el efecto de la superpoblación macromolecular sobre la cinética de hidrólisis de ONPG catalizada por beta-galactosidasa de E.coli; ii) comparar los datos de hidrólisis de ONPG catalizada por beta-Gal obtenidos por espectroscopia UV-Visible (EF) y por ITC, para poder validar la técnica de ITC para estudiar la cinética de enzimas. La condición de SMS se simuló con disoluciones de polietilenglicol PM 6000 (PEG6000) a distintas concentraciones (0 a 35 % P/V). Los resultados obtenidos mostraron que la velocidad de reacción (Vmax) no se vio afectada, mientras que la afinidad de la enzima (KM) sufrió una disminución significativa (KM aumentó de 0,14 a 1 mM para 0 y 35 % P/V PEG6000, respectivamente) a medida que aumentó la concentración de superpoblante. Esta disminución en la afinidad a altas concentración de PEG6000 podría ser ocasionada por la restricción difusional que impone la alta densidad molecular presente en estas condiciones. Los resultados obtenidos por las dos técnicas (EF e ITC) no arrojaron diferencias significativas, permitiéndonos validar el uso del ITC como técnica para estudiar la cinética de reacciones mediadas por enzimas.