BECAS
SAEZ Julieta Susana
congresos y reuniones científicas
Título:
Caracterización preliminar de dos toxinas killer para el biocontrol de levaduras contaminantes de vinos
Autor/es:
JULIETA S. SAEZ; LETICIA VILLALBA; SILVANA DEL MÓNACO; CHRISTIAN A. LOPES; MARCELA P. SANGORRÍN
Lugar:
Mendoza
Reunión:
Jornada; III Jornadas Nacionales de Biología y Biotecnología de Levaduras; 2011
Institución organizadora:
INTA Mendoza
Resumen:
En
nuestro laboratorio se han seleccionado dos cepas de levaduras productoras de
toxinas killer pertenecientes a las
especies Torulaspora
delbrueckii (toxina TdKT) y Wickerhanomyces anomala (toxina WaKT) capaces
de combatir el desarrollo, en ensayos de laboratorio, de levaduras
contaminantes de vinos: Brettanomyces
bruxellensis, Pichia guilliermondii,
Pichia manshurica y Pichia membranifaciens, todas ellas productoras de niveles significativos de fenoles volátiles.
Las toxinas TdKT y WaKT
se obtuvieron a partir del sobrenadante de un cultivo en fase estacionaria en medio
YPD, que fue precipitado con 80% de sulfato de amonio. Para la detección de las
toxinas se utilizó una cepa sensible control de Candida glabrata,
analizando los halos de inhibición del crecimiento en medio YPD-MB-agar, el seguimiento
de DO 650 en microplacas de 96 pocillos con caldo YPD y la viabilidad mediante
ensayos de MTT.
Se evaluó la
estabilidad de las toxinas frente a diferentes condiciones de stress típicas de
vinificación (pH, etanol, temperatura y dióxido de azufre). Ambas fueron
estables a etanol 2-16%, temperatura 0-26°C, pH 3-4,5 y SO2 25-150
ppm, resultando interesantes para su empleo en vinificación. A su vez, las
toxinas mostraron diferente especificidad frente a las levaduras contaminantes.
WaKT fue más efectiva frente a P.
guilliermondii y P. membranifaciens,
mientras que TdKT lo fue frente a P.
guilliermondii, P. manshurica y B. bruxellensis.
Se determinó que la
masa molecular de las dos toxinas es mayor a 30 KDa por filtración diferencial
con membranas de diferente cut-off.
Para conocer el blanco primario de las toxinas se realizaron ensayos de
competencia en placas con YPD-MB-agar, con diferentes polisacáridos de la pared
de levaduras: curdulano, laminarina, manano, pustulano, pululano y quitina,
como también con la lectina ConA. El pustulano (β-1,6-glucano) logró reducir la
actividad de las dos toxinas. Adicionalmente, la lectina redujo la actividad de
TdKT, indicando que las mananoproteínas son también un blanco para la misma.
Para conocer el modo
de acción de las toxinas se utilizaron técnicas de microscopía de fluorescencia que incluyeron
tinción con Calcofluor White, ioduro de propidio, y Hoechst 33342. Los ensayos demostraron que
ambas toxinas inducen procesos apoptóticos en las levaduras sensibles,
afectando la viabilidad celular significativamente a partir de las 24 hs.
Los resultados obtenidos permiten inferir el
uso potencial de ambas toxinas killer
en enología con el fin de lograr vinos sin defectos y con menores riesgos para
la salud al disminuir la utilización de conservantes químicos.