CONTRATADOS
TARGOVNIK Hector Manuel
congresos y reuniones científicas
Título:
Clonado del cDNA WT y mutagenizado del gen de tiroperoxidasa humana responsable de bocio congénito
Autor/es:
BELFORTE, FIORELA SABINA; OSORIO LAROCHE, CAROLINA; OLCESE, MARÍA CECILIA; CITTERIO, CINTIA ELIANA; TARGOVNIK, HÉCTOR MANUEL; RIVOLTA, CARINA MARCELA
Lugar:
Mar del Plata
Reunión:
Congreso; LVII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica.; 2012
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Investigación Clínica.
Resumen:
El gen de Tiroperoxidasa (TPO) es el principal responsable de defectos en la organificación de iodo (IOD) los cuales se vinculan al Hipotiroidismo Congénito (HC), patología de alta prevalencia en Argentina (1/2100). Se propone aquí la obtención del cDNA de TPO para evaluar el impacto funcional de mutaciones identificadas en pacientes con diagnóstico clínico y bioquímico de IOD. La imposibilidad de obtener un TPOmRNA completo, siendo el tejido tiroideo abundante en RNAsas, llevó a diseñar 3 juegos de primers para obtener por RT-PCR 3 fragmentos de cDNA contiguos con parcial solapamiento de 1058, 959 y 1316 pb. Dichos fragmentos fueron clonados independientemente en el vector pGEMTEasy obteniéndose los clones pGEMT-TPO1, pGEMT-TPO2 y pGEMT-TPO3 los cuales fueron digeridos con enzimas de restricción que permitieran el correcto solapamiento de los fragmentos amplificados. Las enzimas Fse1 y Spe1 generaron fragmentos de 3820 y 825 pb a partir de pGEMT-TPO1 y pGEMTTPO2 que ligados dieron lugar al clon pGEMT-TPO1+2. Este constructo junto con el pGEMT-TPO3 fueron clivados con Sma1 y Spe1 generándose 2 fragmentos de 4588 y 1269 pb que luego de ligados dieron origen al clon pGEMT_TPO1+2+3, obteniendo la secuencia proteica completa wt de la TPO (2772 pb). Se utilizó QuikChange XL para reproducir en el clon pGEMT-TPO1+2+3 mutaciones identificadas previamente en nuestro laboratorio (2382 T>C, p.C808R; 1119 G>A, p.G387R; 1456C>T, p.P499L y delC347). Cada una de las construcciones obtenidas al igual que las mutaciones introducidas fueron verificadas por secuenciación. Finalmente se liberaron los cDNAs mutagenizados de TPO por digestión con EcoRI, se purificaron los fragmentos y se ligaron al vector pAcGP67B-8Arg2. Esta estrategia molecular ofrece una valiosa alternativa para la obtención del cDNA del gen de TPO de difícil obtención por las técnicas habituales, permitiendo generar tanto clones wt como mutantes para el futuro estudio funcional de mutaciones responsables de HC.
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