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EFECTOS DE ACETOGENINAS ANNONÁCEAS EN LA TEMPERATURA DE TRANSICION DE MEMBRANAS LIPÍDICAS ARTIFICIALES Lilian Di Toto Blessing3, Olga Álvarez Colom1, Sonia Diaz2, Aída Ben Altabef 2, Adriana Neske1, Alicia Bardón1 1Instituto de Química Orgánica, 2Instituto de Físico Química, Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia, Universidad Nacional de Tucumán, Ayacucho 471, (4000) Tucumán, Argentina.E-mail: aneske@fbqf.unt.edu.ar3, Olga Álvarez Colom1, Sonia Diaz2, Aída Ben Altabef 2, Adriana Neske1, Alicia Bardón1 1Instituto de Química Orgánica, 2Instituto de Físico Química, Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia, Universidad Nacional de Tucumán, Ayacucho 471, (4000) Tucumán, Argentina.E-mail: aneske@fbqf.unt.edu.ar1, Alicia Bardón1 1Instituto de Química Orgánica, 2Instituto de Físico Química, Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia, Universidad Nacional de Tucumán, Ayacucho 471, (4000) Tucumán, Argentina.E-mail: aneske@fbqf.unt.edu.arInstituto de Química Orgánica, 2Instituto de Físico Química, Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia, Universidad Nacional de Tucumán, Ayacucho 471, (4000) Tucumán, Argentina.E-mail: aneske@fbqf.unt.edu.ar 3CONICET, Tucumán, Argentina INTRODUCCION Annonacin y Annonacin-A son acetogeninas annonáceas (ACG) constituyentes de las semillas del fruto de Annona cherimolia, planta de la familia Annonaceae. Los efectos más importantes de estos productos se han descripto sobre líneas celulares de cáncer, particularmente aquellas resistentes a quimioterapia. Su citotoxicidad se debe a que inhiben la síntesis de ATP a nivel del complejo I mitocondrial [1, 2]. Por otra parte se ha descripto reiteradamente la potencia insecticida de las ACG [3, 4], sobre varias plagas clave de cultivos de diferentes lugares del mundo. Estos efectos ubican a las acetogeninas como sustancias altamente promisorias en el campo farmacológico como agroquímico. Más recientemente se ha demostrado que la penetración de las ACG en las membranas, unida a la difusión en las mismas, determina la conformación que adoptará la larga cadena a medida que se aproxima al sitio activo. La conformación que adoptan las ACG en membranas artificiales (que mimetizan las naturales) tiene relación con su actividad citotóxica. Si bien estos estudios han mostrado que la forma en que se ubica la ACG en la membrana influye en la actividad observada, nada se ha dicho sobre los efectos que ocurren en la estructura de la membrana debido a la presencia de las mismas. Se sabe que los patrones de hidratación de las membranas celulares se modifican por agentes externos, alterando la funcionalidad de la misma [5, 6]. OBJETIVOS En el presente trabajo evaluamos los efectos de las acetogeninas annonáceas, annonacin (1) y annonacin-A (2) en la temperatura de transición gel-líquido cristalino en liposomas liofilizados de POPC, mediante estudios de Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC). MATERIALES Y MÉTODOS Las vesículas multilamelares (MLV´s) de POPC se preparan siguiendo el método de Bangham. Las soluciones clorofórmicas de fosfolípido son secadas bajo corriente de nitrógeno hasta obtener un film homogéneo adherido a las paredes del tubo. La hidratación del film lipídico seco se logra incubándolo en D2O. La dispersión mecánica del film lipídico hidratado se realiza con agitación vigorosa, obteniéndose una suspensión opalescente de vesículas multilamelares (MLV). Las suspensiones de vesículas multilamelares de POPC y ACG se preparan disolviendo ambos en CHCl3, se mezclan las soluciones y se evapora a sequedad el solvente. Se resuspende el film lipídico en D2O. Las medidas de Calorimetría Diferencial de Barrido se llevaron a cabo en un equipo Perkin Elmer, Modelo DSC 6, con muestras de liposomas liofilizados de POPC y de POPC/ACG 1 y ACG 2 en una relación molar 1,568:1.CONICET, Tucumán, Argentina INTRODUCCION Annonacin y Annonacin-A son acetogeninas annonáceas (ACG) constituyentes de las semillas del fruto de Annona cherimolia, planta de la familia Annonaceae. Los efectos más importantes de estos productos se han descripto sobre líneas celulares de cáncer, particularmente aquellas resistentes a quimioterapia. Su citotoxicidad se debe a que inhiben la síntesis de ATP a nivel del complejo I mitocondrial [1, 2]. Por otra parte se ha descripto reiteradamente la potencia insecticida de las ACG [3, 4], sobre varias plagas clave de cultivos de diferentes lugares del mundo. Estos efectos ubican a las acetogeninas como sustancias altamente promisorias en el campo farmacológico como agroquímico. Más recientemente se ha demostrado que la penetración de las ACG en las membranas, unida a la difusión en las mismas, determina la conformación que adoptará la larga cadena a medida que se aproxima al sitio activo. La conformación que adoptan las ACG en membranas artificiales (que mimetizan las naturales) tiene relación con su actividad citotóxica. Si bien estos estudios han mostrado que la forma en que se ubica la ACG en la membrana influye en la actividad observada, nada se ha dicho sobre los efectos que ocurren en la estructura de la membrana debido a la presencia de las mismas. Se sabe que los patrones de hidratación de las membranas celulares se modifican por agentes externos, alterando la funcionalidad de la misma [5, 6]. OBJETIVOS En el presente trabajo evaluamos los efectos de las acetogeninas annonáceas, annonacin (1) y annonacin-A (2) en la temperatura de transición gel-líquido cristalino en liposomas liofilizados de POPC, mediante estudios de Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC). MATERIALES Y MÉTODOS Las vesículas multilamelares (MLV´s) de POPC se preparan siguiendo el método de Bangham. Las soluciones clorofórmicas de fosfolípido son secadas bajo corriente de nitrógeno hasta obtener un film homogéneo adherido a las paredes del tubo. La hidratación del film lipídico seco se logra incubándolo en D2O. La dispersión mecánica del film lipídico hidratado se realiza con agitación vigorosa, obteniéndose una suspensión opalescente de vesículas multilamelares (MLV). Las suspensiones de vesículas multilamelares de POPC y ACG se preparan disolviendo ambos en CHCl3, se mezclan las soluciones y se evapora a sequedad el solvente. Se resuspende el film lipídico en D2O. Las medidas de Calorimetría Diferencial de Barrido se llevaron a cabo en un equipo Perkin Elmer, Modelo DSC 6, con muestras de liposomas liofilizados de POPC y de POPC/ACG 1 y ACG 2 en una relación molar 1,568:1.Annona cherimolia, planta de la familia Annonaceae. Los efectos más importantes de estos productos se han descripto sobre líneas celulares de cáncer, particularmente aquellas resistentes a quimioterapia. Su citotoxicidad se debe a que inhiben la síntesis de ATP a nivel del complejo I mitocondrial [1, 2]. Por otra parte se ha descripto reiteradamente la potencia insecticida de las ACG [3, 4], sobre varias plagas clave de cultivos de diferentes lugares del mundo. Estos efectos ubican a las acetogeninas como sustancias altamente promisorias en el campo farmacológico como agroquímico. Más recientemente se ha demostrado que la penetración de las ACG en las membranas, unida a la difusión en las mismas, determina la conformación que adoptará la larga cadena a medida que se aproxima al sitio activo. La conformación que adoptan las ACG en membranas artificiales (que mimetizan las naturales) tiene relación con su actividad citotóxica. Si bien estos estudios han mostrado que la forma en que se ubica la ACG en la membrana influye en la actividad observada, nada se ha dicho sobre los efectos que ocurren en la estructura de la membrana debido a la presencia de las mismas. Se sabe que los patrones de hidratación de las membranas celulares se modifican por agentes externos, alterando la funcionalidad de la misma [5, 6]. OBJETIVOS En el presente trabajo evaluamos los efectos de las acetogeninas annonáceas, annonacin (1) y annonacin-A (2) en la temperatura de transición gel-líquido cristalino en liposomas liofilizados de POPC, mediante estudios de Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC). MATERIALES Y MÉTODOS Las vesículas multilamelares (MLV´s) de POPC se preparan siguiendo el método de Bangham. Las soluciones clorofórmicas de fosfolípido son secadas bajo corriente de nitrógeno hasta obtener un film homogéneo adherido a las paredes del tubo. La hidratación del film lipídico seco se logra incubándolo en D2O. La dispersión mecánica del film lipídico hidratado se realiza con agitación vigorosa, obteniéndose una suspensión opalescente de vesículas multilamelares (MLV). Las suspensiones de vesículas multilamelares de POPC y ACG se preparan disolviendo ambos en CHCl3, se mezclan las soluciones y se evapora a sequedad el solvente. Se resuspende el film lipídico en D2O. Las medidas de Calorimetría Diferencial de Barrido se llevaron a cabo en un equipo Perkin Elmer, Modelo DSC 6, con muestras de liposomas liofilizados de POPC y de POPC/ACG 1 y ACG 2 en una relación molar 1,568:1.2O. La dispersión mecánica del film lipídico hidratado se realiza con agitación vigorosa, obteniéndose una suspensión opalescente de vesículas multilamelares (MLV). Las suspensiones de vesículas multilamelares de POPC y ACG se preparan disolviendo ambos en CHCl3, se mezclan las soluciones y se evapora a sequedad el solvente. Se resuspende el film lipídico en D2O. Las medidas de Calorimetría Diferencial de Barrido se llevaron a cabo en un equipo Perkin Elmer, Modelo DSC 6, con muestras de liposomas liofilizados de POPC y de POPC/ACG 1 y ACG 2 en una relación molar 1,568:1.3, se mezclan las soluciones y se evapora a sequedad el solvente. Se resuspende el film lipídico en D2O. Las medidas de Calorimetría Diferencial de Barrido se llevaron a cabo en un equipo Perkin Elmer, Modelo DSC 6, con muestras de liposomas liofilizados de POPC y de POPC/ACG 1 y ACG 2 en una relación molar 1,568:1.2O. Las medidas de Calorimetría Diferencial de Barrido se llevaron a cabo en un equipo Perkin Elmer, Modelo DSC 6, con muestras de liposomas liofilizados de POPC y de POPC/ACG 1 y ACG 2 en una relación molar 1,568:1. O (CH2)112)11 OH O O HO (CH2)42)4 OH CH33 OH annonacin (ACG 1)(ACG 1) O (CH2)112)11 OH O O (CH2)42)4 OH CH33 OH annonacin-A OH-A OH (ACG2) RESULTADOS Y DISCUSIÓN Las alteraciones de la estructura de la membrana estarían fuertemente vinculadas a la actividad biológica. Con el fin de verificar experimentalmente si la toxicidad de las acetogeninas annonáceas está relacionada con las probables alteraciones que ellas provocan en los principales grupos de hidratación de las membranas lipídicas artificiales, se estudió la interacción de las mismas con membranas lipídicas de POPC (palmitoiloleoilfosfatidilcolina) en estados gel y líquido cristalino por FTIR. Teniendo en cuenta que los principales sitios de hidratación de las bicapas lipídicas son los grupos carbonilo del éster y fosfato en la interfaz lipídica, se analizaron los corrimientos en los números de onda de los mismos y de los grupos CH2 y CH3 de la cadena hidrocarbonada en el interior de la misma. Para ambos estados se observaron corrimientos a frecuencias menores, lo que indicó que las ACG modifican los patrones de hidratación del entorno de los grupos carbonilo y fosfato del liposoma y por lo tanto interactúan con los carbonilos y fosfatos de las membranas [7, 8]. Los resultados de Calorimetría Diferencial de Barrido muestran un corrimiento en la temperatura de transición de los sistemas lípido/acetogeninas con respecto a la temperatura de transición del POPC reportada en la bibliografía [9]. El corrimiento a mayores temperaturas nos indicaría pérdida del agua estructurada en los grupos C=O y PO4 2- en la cabeza polar del lípido. CONCLUSIONES2 y CH3 de la cadena hidrocarbonada en el interior de la misma. Para ambos estados se observaron corrimientos a frecuencias menores, lo que indicó que las ACG modifican los patrones de hidratación del entorno de los grupos carbonilo y fosfato del liposoma y por lo tanto interactúan con los carbonilos y fosfatos de las membranas [7, 8]. Los resultados de Calorimetría Diferencial de Barrido muestran un corrimiento en la temperatura de transición de los sistemas lípido/acetogeninas con respecto a la temperatura de transición del POPC reportada en la bibliografía [9]. El corrimiento a mayores temperaturas nos indicaría pérdida del agua estructurada en los grupos C=O y PO4 2- en la cabeza polar del lípido. CONCLUSIONES4 2- en la cabeza polar del lípido. CONCLUSIONESen la cabeza polar del lípido. CONCLUSIONES �� Se reportan las temperaturas de fusión de las acetogeninas annonáceas: annonacin y annonacin-A.Se reportan las temperaturas de fusión de las acetogeninas annonáceas: annonacin y annonacin-A. �� Los resultados permitieron establecer cómo el agua de hidratación contribuye a los procesos de transición de fase gel-líquido cristalino, a la estabilidad de las bicapas y a conjeturar sobre sus propiedades fisicoquímicas. REFERENCIASLos resultados permitieron establecer cómo el agua de hidratación contribuye a los procesos de transición de fase gel-líquido cristalino, a la estabilidad de las bicapas y a conjeturar sobre sus propiedades fisicoquímicas. REFERENCIAS 1 Barrachina, I.; Neske, A.; Granell, S.; Bermejo, A.; Chahaboune, N.; El Aoued, N.; Alvarez Colom, O.; Bardón , A.; Zafra-Polo, M.C. 2004 Planta Médica, 70: 866-868Barrachina, I.; Neske, A.; Granell, S.; Bermejo, A.; Chahaboune, N.; El Aoued, N.; Alvarez Colom, O.; Bardón , A.; Zafra-Polo, M.C. 2004 Planta Médica, 70: 866-868 2 Olga Alvarez Colom, Adriana Neske, Nadia Chahboune, M. Carmen Zafra-Polo, Alicia Bardón. 2008 Chemistry and BiodiversityOlga Alvarez Colom, Adriana Neske, Nadia Chahboune, M. Carmen Zafra-Polo, Alicia Bardón. 2008 Chemistry and Biodiversity 3 Álvarez Colom, O.; Neske, A.; Popich, S.; Bardón A.; 2007 J. of Pest Science 80: 63- 67.Álvarez Colom, O.; Neske, A.; Popich, S.; Bardón A.; 2007 J. of Pest Science 80: 63- 67. 4 Olga Alvarez Colom, Adriana Neske, Borrachina Isabel, Ayala Mingol Idelfonso, Moya Sanz Pilar y Alicia Bardón, 2008 J. of Pest Science.Olga Alvarez Colom, Adriana Neske, Borrachina Isabel, Ayala Mingol Idelfonso, Moya Sanz Pilar y Alicia Bardón, 2008 J. of Pest Science. 5 Díaz, S. B.; Amalfa F.; Biondi de López A.C. y Disalvo E. A. 1999 Langmuir, 15: 5179-5182Díaz, S. B.; Amalfa F.; Biondi de López A.C. y Disalvo E. A. 1999 Langmuir, 15: 5179-5182 6 Hübner, W. and Blume, A. 1998 Chemistry and Physics of Lipids, 96: 99-123Hübner, W. and Blume, A. 1998 Chemistry and Physics of Lipids, 96: 99-123 7 Di Toto Blessing L., Díaz S. B., Ben Altabef A., Neske A., Bardón A. 2007. International Workshop on Infrared Spectroscopy Applied to Biological and Biomimmetic Systems: From the Isolated Molecule to the CellDi Toto Blessing L., Díaz S. B., Ben Altabef A., Neske A., Bardón A. 2007. International Workshop on Infrared Spectroscopy Applied to Biological and Biomimmetic Systems: From the Isolated Molecule to the Cell 8 Álvarez Colom Olga, Diaz Sonia, Ben Altabef Aída, Neske Adriana, Bardón Alicia. 2007. XVI Simposio Nacional de Química Orgánica 1º Iberoamericano de QuímicaÁlvarez Colom Olga, Diaz Sonia, Ben Altabef Aída, Neske Adriana, Bardón Alicia. 2007. XVI Simposio Nacional de Química Orgánica 1º Iberoamericano de Química 9 Heidi M Mansour, George Zografi. 2006. J. of Pharmaceutical Science, 1-20Heidi M Mansour, George Zografi. 2006. J. of Pharmaceutical Science, 1-20