CONICET | Buscador de Institutos y Recursos Humanos

4. Química Física ESTUDIO POR FTIR DE LA INTERACCIÓN DE METANTIOSULFONATO DE METILO CON MEMBRANAS LIPÍDICAS María E. Defonsi Lestard, Sonia B. Díaz, María E. Tuttolomondo, Aida Ben Altabef Cátedra de Fisicoquímica I, Instituto de Química Física, Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia, Universidad Nacional de Tucumán, San Lorenzo 456, T4000CAN Tucumán, R. Argentina. elianadefonsi@yahoo.com.arelianadefonsi@yahoo.com.ar INTRODUCCION: Pensando en la célula como un sistema integrado, el contenido de agua está dado por regulación del volumen acuoso en su interior a través de mecanismos de transporte en la membrana y por la contribución del agua estructurada a la estabilidad de las estructuras celulares. Los sistemas biológicos están compartimentalizados por membranas cuya estructura principal, la bicapa lipídica, se estabiliza por la hidratación de los fosfolípidos. En particular, las propiedades interfaciales de las membranas biológicas son un punto de especial atención que afecta a ambos procesos. Por ejemplo, los estados del agua en la interfaz de una membrana pueden incidir en la estabilización de la misma y en el mecanismo de inserción y regulación de péptidos transportadores de agua.[1-3][1-3] Resultados de espectroscopia de infrarrojo por Transformadas de Fourier han indicado que los sitios de hidratación principales son los grupos carbonilo y fosfato. Por otro lado en 1993 Nakamura y col.[4] aislaron S-metil metanotiosulfonato (MMTS) de coliflor, Brassica oleracea L. var. Botrytis, y encontraron que inhibe la mutación inducida en Escherichia coli. En 1997 Sugie y col.[5] examinaron[4] aislaron S-metil metanotiosulfonato (MMTS) de coliflor, Brassica oleracea L. var. Botrytis, y encontraron que inhibe la mutación inducida en Escherichia coli. En 1997 Sugie y col.[5] examinaron[5] examinaron el efecto de modificación de MMTS en carcinogénesis de intestino grueso y encontraron que este compuesto organosulfurado tiene un fuerte efecto protectivo. Además confirmaron la actividad antioxidante del MMTS frente a la peroxidación de lípidos en membranas ghosts de eritrocitos de conejo o hepatocitos de rata. Los resultados de recientes investigaciones sugieren que MMTS es un agente quimiopreventivo promisorio para neoplasmas de hígado humano. El presente estudio es un primer paso a la investigación de la interacción de MMTS con sistemas modelo de membranas como son los liposomas. Éstos son vesículas sintéticas biodegradables y no tóxicas que nos permitirán extrapolar los resultados obtenidos a sistemas más complejos como las membranas biológicas. OBJETIVOS: Estudiar la interacción de membranas lipídicas con MMTS mediante espectroscopia de infrarrojo por Transformadas de Fourier (FTIR), a efectos de conocer los sitios específicos de interacción en las bicapas lipídicas. Complementar estos resultados con un análisis teórico de los sitios reactivos de MMTS y así obtener una mayor comprensión a nivel molecular de su mecanismo de acción (efecto quimioprotector) en los sistemas biológicos. METODOLOGÍA: 1) Experimental: Se estudiaron por FTIR los posibles cambios estructurales producidos en liposomas multilamelares de DPPC (dipalmitoilfosfatidilcolina) con S-metil metanotiosulfonato (MMTS) en diferentes relaciones molares. Las vesículas multilamelares (MLV´s) de DPPC se prepararon siguiendo el método de Bangham. Las soluciones clorofórmicas del fosfolípido fueron secadas bajo corriente de nitrógeno hasta obtener un film homogéneo adherido a las paredes del tubo. La hidratación del film lipídico seco se logró resuspendiendo en D2O, a una temperatura 10 °C superior a la de transición de fase del lípido (Tt = 41 °C). La dispersión mecánica del film lipídico hidratado se realizó con agitación vigorosa, obteniéndose una suspensión opalescente de vesículas multilamelares (MLV) cuyo tamaño varía entre 5 y 50 μm de diámetro. Las suspensiones de vesículas multilamelares de DPPC y MMTS se prepararon disolviendo ambos en CHCl3, mezclando las soluciones y evaporando a sequedad el solvente. Se resuspendió el film lipídico en D2O después se dejó incubando por siete días. La concentración final de las vesículas MLV´s fue de 40 mg/ml. Se analizó los corrimientos en el números de onda, principalmente en las bandas de los grupos fosfato (PO2 -) y carbonilo a nivel de la interfaz lipídica (región hidrofílica), como también los del interior de la bicapa lipídica (región hidrofóbica o hidrocarbonada) para conocer los sitios específicos de interacción con la membrana lipídica lo que nos permitió tener una mayor comprensión a nivel molecular de su mecanismo quimioprotector. 2) Cálculos teóricos: El cálculo de la geometría optimizada se realizó con el programa Gaussian 03 [6], usando los siguientes métodos; B3LYP y MP2 con las bases: cc-pVDZ, 6-31G*, 6-311G** y 631++G**, tomando al átomo de azufre por separado con la base 6-31G(2df). A partir de esas estructuras optimizadas se estudió la densidad electrónica del MMST, con el programa AIM2000, lo que se completó con el estudio de los orbitales enlazantes con el programa NBO. RESULTADOS: Estudios por FTIR, de lípidos y otras moléculas con grupos fosfato en la región interfacial mostraron que estas bandas son fuertemente dependientes del estado de hidratación y son sensibles al enlace hidrógeno [7]2O, a una temperatura 10 °C superior a la de transición de fase del lípido (Tt = 41 °C). La dispersión mecánica del film lipídico hidratado se realizó con agitación vigorosa, obteniéndose una suspensión opalescente de vesículas multilamelares (MLV) cuyo tamaño varía entre 5 y 50 μm de diámetro. Las suspensiones de vesículas multilamelares de DPPC y MMTS se prepararon disolviendo ambos en CHCl3, mezclando las soluciones y evaporando a sequedad el solvente. Se resuspendió el film lipídico en D2O después se dejó incubando por siete días. La concentración final de las vesículas MLV´s fue de 40 mg/ml. Se analizó los corrimientos en el números de onda, principalmente en las bandas de los grupos fosfato (PO2 -) y carbonilo a nivel de la interfaz lipídica (región hidrofílica), como también los del interior de la bicapa lipídica (región hidrofóbica o hidrocarbonada) para conocer los sitios específicos de interacción con la membrana lipídica lo que nos permitió tener una mayor comprensión a nivel molecular de su mecanismo quimioprotector. 2) Cálculos teóricos: El cálculo de la geometría optimizada se realizó con el programa Gaussian 03 [6], usando los siguientes métodos; B3LYP y MP2 con las bases: cc-pVDZ, 6-31G*, 6-311G** y 631++G**, tomando al átomo de azufre por separado con la base 6-31G(2df). A partir de esas estructuras optimizadas se estudió la densidad electrónica del MMST, con el programa AIM2000, lo que se completó con el estudio de los orbitales enlazantes con el programa NBO. RESULTADOS: Estudios por FTIR, de lípidos y otras moléculas con grupos fosfato en la región interfacial mostraron que estas bandas son fuertemente dependientes del estado de hidratación y son sensibles al enlace hidrógeno [7]°C superior a la de transición de fase del lípido (Tt = 41 °C). La dispersión mecánica del film lipídico hidratado se realizó con agitación vigorosa, obteniéndose una suspensión opalescente de vesículas multilamelares (MLV) cuyo tamaño varía entre 5 y 50 μm de diámetro. Las suspensiones de vesículas multilamelares de DPPC y MMTS se prepararon disolviendo ambos en CHCl3, mezclando las soluciones y evaporando a sequedad el solvente. Se resuspendió el film lipídico en D2O después se dejó incubando por siete días. La concentración final de las vesículas MLV´s fue de 40 mg/ml. Se analizó los corrimientos en el números de onda, principalmente en las bandas de los grupos fosfato (PO2 -) y carbonilo a nivel de la interfaz lipídica (región hidrofílica), como también los del interior de la bicapa lipídica (región hidrofóbica o hidrocarbonada) para conocer los sitios específicos de interacción con la membrana lipídica lo que nos permitió tener una mayor comprensión a nivel molecular de su mecanismo quimioprotector. 2) Cálculos teóricos: El cálculo de la geometría optimizada se realizó con el programa Gaussian 03 [6], usando los siguientes métodos; B3LYP y MP2 con las bases: cc-pVDZ, 6-31G*, 6-311G** y 631++G**, tomando al átomo de azufre por separado con la base 6-31G(2df). A partir de esas estructuras optimizadas se estudió la densidad electrónica del MMST, con el programa AIM2000, lo que se completó con el estudio de los orbitales enlazantes con el programa NBO. RESULTADOS: Estudios por FTIR, de lípidos y otras moléculas con grupos fosfato en la región interfacial mostraron que estas bandas son fuertemente dependientes del estado de hidratación y son sensibles al enlace hidrógeno [7]μm de diámetro. Las suspensiones de vesículas multilamelares de DPPC y MMTS se prepararon disolviendo ambos en CHCl3, mezclando las soluciones y evaporando a sequedad el solvente. Se resuspendió el film lipídico en D2O después se dejó incubando por siete días. La concentración final de las vesículas MLV´s fue de 40 mg/ml. Se analizó los corrimientos en el números de onda, principalmente en las bandas de los grupos fosfato (PO2 -) y carbonilo a nivel de la interfaz lipídica (región hidrofílica), como también los del interior de la bicapa lipídica (región hidrofóbica o hidrocarbonada) para conocer los sitios específicos de interacción con la membrana lipídica lo que nos permitió tener una mayor comprensión a nivel molecular de su mecanismo quimioprotector. 2) Cálculos teóricos: El cálculo de la geometría optimizada se realizó con el programa Gaussian 03 [6], usando los siguientes métodos; B3LYP y MP2 con las bases: cc-pVDZ, 6-31G*, 6-311G** y 631++G**, tomando al átomo de azufre por separado con la base 6-31G(2df). A partir de esas estructuras optimizadas se estudió la densidad electrónica del MMST, con el programa AIM2000, lo que se completó con el estudio de los orbitales enlazantes con el programa NBO. RESULTADOS: Estudios por FTIR, de lípidos y otras moléculas con grupos fosfato en la región interfacial mostraron que estas bandas son fuertemente dependientes del estado de hidratación y son sensibles al enlace hidrógeno [7]DPPC y MMTS se prepararon disolviendo ambos en CHCl3, mezclando las soluciones y evaporando a sequedad el solvente. Se resuspendió el film lipídico en D2O después se dejó incubando por siete días. La concentración final de las vesículas MLV´s fue de 40 mg/ml. Se analizó los corrimientos en el números de onda, principalmente en las bandas de los grupos fosfato (PO2 -) y carbonilo a nivel de la interfaz lipídica (región hidrofílica), como también los del interior de la bicapa lipídica (región hidrofóbica o hidrocarbonada) para conocer los sitios específicos de interacción con la membrana lipídica lo que nos permitió tener una mayor comprensión a nivel molecular de su mecanismo quimioprotector. 2) Cálculos teóricos: El cálculo de la geometría optimizada se realizó con el programa Gaussian 03 [6], usando los siguientes métodos; B3LYP y MP2 con las bases: cc-pVDZ, 6-31G*, 6-311G** y 631++G**, tomando al átomo de azufre por separado con la base 6-31G(2df). A partir de esas estructuras optimizadas se estudió la densidad electrónica del MMST, con el programa AIM2000, lo que se completó con el estudio de los orbitales enlazantes con el programa NBO. RESULTADOS: Estudios por FTIR, de lípidos y otras moléculas con grupos fosfato en la región interfacial mostraron que estas bandas son fuertemente dependientes del estado de hidratación y son sensibles al enlace hidrógeno [7]3, mezclando las soluciones y evaporando a sequedad el solvente. Se resuspendió el film lipídico en D2O después se dejó incubando por siete días. La concentración final de las vesículas MLV´s fue de 40 mg/ml. Se analizó los corrimientos en el números de onda, principalmente en las bandas de los grupos fosfato (PO2 -) y carbonilo a nivel de la interfaz lipídica (región hidrofílica), como también los del interior de la bicapa lipídica (región hidrofóbica o hidrocarbonada) para conocer los sitios específicos de interacción con la membrana lipídica lo que nos permitió tener una mayor comprensión a nivel molecular de su mecanismo quimioprotector. 2) Cálculos teóricos: El cálculo de la geometría optimizada se realizó con el programa Gaussian 03 [6], usando los siguientes métodos; B3LYP y MP2 con las bases: cc-pVDZ, 6-31G*, 6-311G** y 631++G**, tomando al átomo de azufre por separado con la base 6-31G(2df). A partir de esas estructuras optimizadas se estudió la densidad electrónica del MMST, con el programa AIM2000, lo que se completó con el estudio de los orbitales enlazantes con el programa NBO. RESULTADOS: Estudios por FTIR, de lípidos y otras moléculas con grupos fosfato en la región interfacial mostraron que estas bandas son fuertemente dependientes del estado de hidratación y son sensibles al enlace hidrógeno [7]2O después se dejó incubando por siete días. La concentración final de las vesículas MLV´s fue de 40 mg/ml. Se analizó los corrimientos en el números de onda, principalmente en las bandas de los grupos fosfato (PO2 -) y carbonilo a nivel de la interfaz lipídica (región hidrofílica), como también los del interior de la bicapa lipídica (región hidrofóbica o hidrocarbonada) para conocer los sitios específicos de interacción con la membrana lipídica lo que nos permitió tener una mayor comprensión a nivel molecular de su mecanismo quimioprotector. 2) Cálculos teóricos: El cálculo de la geometría optimizada se realizó con el programa Gaussian 03 [6], usando los siguientes métodos; B3LYP y MP2 con las bases: cc-pVDZ, 6-31G*, 6-311G** y 631++G**, tomando al átomo de azufre por separado con la base 6-31G(2df). A partir de esas estructuras optimizadas se estudió la densidad electrónica del MMST, con el programa AIM2000, lo que se completó con el estudio de los orbitales enlazantes con el programa NBO. RESULTADOS: Estudios por FTIR, de lípidos y otras moléculas con grupos fosfato en la región interfacial mostraron que estas bandas son fuertemente dependientes del estado de hidratación y son sensibles al enlace hidrógeno [7]2 -) y carbonilo a nivel de la interfaz lipídica (región hidrofílica), como también los del interior de la bicapa lipídica (región hidrofóbica o hidrocarbonada) para conocer los sitios específicos de interacción con la membrana lipídica lo que nos permitió tener una mayor comprensión a nivel molecular de su mecanismo quimioprotector. 2) Cálculos teóricos: El cálculo de la geometría optimizada se realizó con el programa Gaussian 03 [6], usando los siguientes métodos; B3LYP y MP2 con las bases: cc-pVDZ, 6-31G*, 6-311G** y 631++G**, tomando al átomo de azufre por separado con la base 6-31G(2df). A partir de esas estructuras optimizadas se estudió la densidad electrónica del MMST, con el programa AIM2000, lo que se completó con el estudio de los orbitales enlazantes con el programa NBO. RESULTADOS: Estudios por FTIR, de lípidos y otras moléculas con grupos fosfato en la región interfacial mostraron que estas bandas son fuertemente dependientes del estado de hidratación y son sensibles al enlace hidrógeno [7]) y carbonilo a nivel de la interfaz lipídica (región hidrofílica), como también los del interior de la bicapa lipídica (región hidrofóbica o hidrocarbonada) para conocer los sitios específicos de interacción con la membrana lipídica lo que nos permitió tener una mayor comprensión a nivel molecular de su mecanismo quimioprotector. 2) Cálculos teóricos: El cálculo de la geometría optimizada se realizó con el programa Gaussian 03 [6], usando los siguientes métodos; B3LYP y MP2 con las bases: cc-pVDZ, 6-31G*, 6-311G** y 631++G**, tomando al átomo de azufre por separado con la base 6-31G(2df). A partir de esas estructuras optimizadas se estudió la densidad electrónica del MMST, con el programa AIM2000, lo que se completó con el estudio de los orbitales enlazantes con el programa NBO. RESULTADOS: Estudios por FTIR, de lípidos y otras moléculas con grupos fosfato en la región interfacial mostraron que estas bandas son fuertemente dependientes del estado de hidratación y son sensibles al enlace hidrógeno [7][6], usando los siguientes métodos; B3LYP y MP2 con las bases: cc-pVDZ, 6-31G*, 6-311G** y 631++G**, tomando al átomo de azufre por separado con la base 6-31G(2df). A partir de esas estructuras optimizadas se estudió la densidad electrónica del MMST, con el programa AIM2000, lo que se completó con el estudio de los orbitales enlazantes con el programa NBO. RESULTADOS: Estudios por FTIR, de lípidos y otras moléculas con grupos fosfato en la región interfacial mostraron que estas bandas son fuertemente dependientes del estado de hidratación y son sensibles al enlace hidrógeno [7][7] (Figura 1) La disminución en las frecuencias se explicarían por una mayor interacción por hidratación de la muestra con H2O o D2O o por interacción con moléculas capaces de reemplazar agua estructurada en la interfaz, como los azúcares. La trehalosa es más efectiva que la sacarosa ya que la primera formaría fuertes enlaces hidrógeno tanto con C=O y PO2 - y la segunda sólo con el grupo fosfato.2O o D2O o por interacción con moléculas capaces de reemplazar agua estructurada en la interfaz, como los azúcares. La trehalosa es más efectiva que la sacarosa ya que la primera formaría fuertes enlaces hidrógeno tanto con C=O y PO2 - y la segunda sólo con el grupo fosfato.2 - y la segunda sólo con el grupo fosfato.y la segunda sólo con el grupo fosfato. [7,8]. Se observa un marcado desplazamiento hacia menores números de onda de la banda correspondiente al estiramiento del grupo carbonilo en el sistema DPPC/MMTS con respecto al lípido puro. La interacción con el grupo fosfato, indicaría la formación de enlaces hidrógeno, para el sistema DPPC/MMTS.7,8]. Se observa un marcado desplazamiento hacia menores números de onda de la banda correspondiente al estiramiento del grupo carbonilo en el sistema DPPC/MMTS con respecto al lípido puro. La interacción con el grupo fosfato, indicaría la formación de enlaces hidrógeno, para el sistema DPPC/MMTS. Figura 1- Corrimiento de la banda en el espectro FTIR del grupo C=O de: a- liposomas de DPPC; b- liposomas de DPPC/ MMTS en D2O.- Corrimiento de la banda en el espectro FTIR del grupo C=O de: a- liposomas de DPPC; b- liposomas de DPPC/ MMTS en D2O.2O. No se observaron corrimientos significativos en la frecuencia de los grupos CH3, CH23, CH2 correspondientes al interior de la bicapa lipídica. El estudio del potencial electrostático nos revela los posibles sitios de un ataque nucleofílico o electrofílico. Un valor negativo del V(r) está asociado con un sitio de alta densidad electrónica y son los sitios de un posible ataque electrofílico, que para la molécula de MMTS es la región (rojo) de los átomos de oxígeno y en menor medida la de los átomos de azufre (verde). Mientras que se observa claramente en azul la zona de potencial V (r) positiva, la cual es un posible sitio de un ataque nucleofílico; esta zona está completamente dominada por los grupos metilo (Figura 2). CONCLUSIONES: �� Se pudo diferenciar por FTIR, en la cabeza polar de los lípidos, zonas específicas de interacción de MMTS en la interfaz de la membrana como la del PO2 - y la del C=O.Se pudo diferenciar por FTIR, en la cabeza polar de los lípidos, zonas específicas de interacción de MMTS en la interfaz de la membrana como la del PO2 - y la del C=O.2 - y la del C=O.y la del C=O. �� El MMTS formaría fuertes enlaces hidrógeno, más efectivos con el grupo C=O que con el PO2 - . REFERENCIAS:El MMTS formaría fuertes enlaces hidrógeno, más efectivos con el grupo C=O que con el PO2 - . REFERENCIAS:2 - . REFERENCIAS:. REFERENCIAS: 1- Hübner W., Blume A., Chemistry and Physics of Lipids, 96, 99-123 (1998)Hübner W., Blume A., Chemistry and Physics of Lipids, 96, 99-123 (1998) 2- S. B. Díaz; F. Amalfa.; A. C. Biondi de López y E.A. Disalvo, Langmuir, 15, 5179- 5182 (1999).S. B. Díaz; F. Amalfa.; A. C. Biondi de López y E.A. Disalvo, Langmuir, 15, 5179- 5182 (1999). 3- Díaz S. B., Lairion F., Arroyo J., Biondi A. C., Langmuir: 17(3), 852-855 (2001). 4 4- Nakamura, Y., Matsuo, T., Shimoi, K., Nakamura, Y. and Tomita, I., Biol. Pharm. Bull., 16, 207-209. (1993).Díaz S. B., Lairion F., Arroyo J., Biondi A. C., Langmuir: 17(3), 852-855 (2001). 4 4- Nakamura, Y., Matsuo, T., Shimoi, K., Nakamura, Y. and Tomita, I., Biol. Pharm. Bull., 16, 207-209. (1993).Nakamura, Y., Matsuo, T., Shimoi, K., Nakamura, Y. and Tomita, I., Biol. Pharm. Bull., 16, 207-209. (1993). 5- Sugie S., Okamoto K., Ohnishi M., Makita H., Kawamori T., Watanabe T., Tanaka T., Nakamura Y. K., Nakamura Y., Tomita I. and Mori H., Jpn. J. Cancer Res. , 88, 5-11 (1997).Sugie S., Okamoto K., Ohnishi M., Makita H., Kawamori T., Watanabe T., Tanaka T., Nakamura Y. K., Nakamura Y., Tomita I. and Mori H., Jpn. J. Cancer Res. , 88, 5-11 (1997). 6- Gaussian 03, Revision B.02, Gaussian, Inc., Pittsburgh PA, 2003. 7- Lewis R. N. A. H., McElhaney R. N., Chem. Phys. Lipids, 96,9-21. (1998).- Lewis R. N. A. H., McElhaney R. N., Chem. Phys. Lipids, 96,9-21. (1998). 8- Diaz S. B., Tesis Doctoral, UNT, 2001.- Diaz S. B., Tesis Doctoral, UNT, 2001. Figura 2- Mapa de contorno del potencial electrostático calculado para el MMTS- Mapa de contorno del potencial electrostático calculado para el MMTS