Vectores baculovirales combinados: Exposición superficial de antígenos y transducción de genes para la prevención de la fiebre hemorrágica argentina

PIDRE, M.L.; SAPIR, M.; HAASE, S.; URE, A.; GÓMEZ, R.M.; ROMANOWSKI

Buenos Aires

Congreso; Pidre, M.L.; Sapir, M.; Haase, S.; Ure, A.; Gómez, R.M.; Romanowski, V. XI Congreso Argentino de Virología. II Congreso Latinoamericano de Virología; 2015

Sociedad Argentina de Virología - Asociación Argentina de Microbiología

0214 - VECTORES BACULOVIRALES COMBINADOS: EXPOSICIÓN SUPERFICIAL DE ANTÍGENOS Y TRANSDUCCIÓN DE GENES PARA LA PREVENCIÓN DE LA FIEBRE HEMORRÁGICA ARGENTINA.ML Pidre, M Sapir, S Haase, AE Ure, RM Gómez, V RomanowskiInstituto de Biotecnología y Biología Molecular (IBBM, UNLP-CONICET), Facultad de Ciencias Exactas, UNLP. Calle 115 y 49, (1900) La Plata, Argentina.Los baculovirus son virus envueltos cuyo genoma consiste en una molécula de DNA doble hebra de entre 80 kpb hasta 180 kpb. La estrategia de baculovirus display apunta a la obtención de memoria inmunológica dependiente de baculovirus y se basa principalmente en la exposición de uno o más epítopes de interés en la forma de un polipéptido quimérico fusionado a la proteína transmembrana mayoritaria de los viriones brotantes, GP64. Con algunas modificaciones esta estrategia permite expresar los genes seleccionados en células de mamíferos utilizando a los baculovirus recombinantes (recBVs) como vehículos de transducción, permitiendo la generación de una respuesta celular específica, además de humoral. De allí nuestro interés en desarrollar un sistema de este tipo para el abordaje de la prevención de la fiebre hemorrágica argentina (FHA). Inicialmente se amplificó el gen completo de gp64 por PCR y se clonó el producto de amplificación en el vector pCR4-TOPO. Se modificó el gen de gp64 por PCR con el objetivo de incorporar sitios de clonado en el marco de lectura de la glicoproteína. Con el fin de desarrollar un sistema rápido y versátil para la obtención de recBVs, se utilizó como material de partida el vector de transferencia pBAcPak9 del sistema de recombinación bAcGOZA. En ese contexto, se clonó el gen modificado de gp64 en dicho vector de transferencia. El vector resultante fue denominado pBAcDis. Asimismo, se amplificó por PCR la secuencia completa de la subunidad G1 de la glicoproteína de superficie del virus Junín (JUNV). De forma complementaria, se realizó un análisis bioinformático para predecir los sitios de interacción de la subunidad G1 de JUNV con su receptor y utilizar ese fragmento como posible inmunógeno. Posteriormente se obtuvo por PCR el fragmento de 120 pb (G1PD) predicho in silico. Finalmente, los fragmentos correspondientes a G1 y G1PD fueron clonados en el vector de transferencia generado anteriormente. Además, se utilizaron dos construcciones adicionales constituidas por el ORF completo de la glicoproteína GPC de JUNV clonada en el vector pBAcPak9, bajo el control del promotor de la poliedrina baculoviral y bajo el control del promotor del gen ie1 de citomegalovirus respectivamente. A continuación, se co-transfectó el DNA del bácmido bAcGOZA y las construcciones plasmídicas mencionadas como complejos formados con lípidos catiónicos. De este modo se obtuvieron los recBVs y se confirmó por PCR la incorporación de los genes heterólogos. Posteriormente, se infectaron células de insecto High Five o células de mamífero Vero (según corresponda) con los recBVs y se evidenció la expresión de las proteínas recombinantes por SDS-PAGE, western blot, ELISA, inmunofluorescencia y citometría de flujo. La obtención de estos recombinantes permitirá en el corto y mediano plazo la utilización de los mismos como vectores de vacunación de modelos animales con el objetivo de desarrollar una alternativa a la vacuna ya existente contra la FHA.