Obtención de cepas de Bradyrhizobium glifosato-tolerantes, por técnicas ?limpias? de ingeniería genética

QUELAS, JI; LEPEK, V

San Martín

Exposición; Competencia de proyectos biotecnológicos BIOTEC+75K; 2015

Cámara Argentina de Biotecnología e Instituto de Investigaciones Biotecnológicas de la UNSAM

El nitrógeno es un elemento fundamental para sustentar la vida. Aunque el nitrógeno está presente en altos niveles en nuestra atmósfera, las plantas solo pueden utilizar formas combinadas (fijadas) del mismo. El proceso por el cual se transforma el nitrógeno en una forma metabolizable, proceso de fijación de nitrógeno, es segundo en importancia, después de la fotosíntesis, para el crecimiento y desarrollo de las plantas. El nitrógeno es uno de los factores limitantes en la producción agrícola con fines alimenticios y energéticos. El proceso de Haber-Bosch por el cual el nitrógeno atmosférico es convertido en amonio, produce ~107 toneladas/año de amonio y es la base de la mayoría de los fertilizantes nitrogenados. Sin embargo, este proceso es demandante de energía y ambientalmente tóxico ya que libera dióxido de carbono y contribuye a un efecto de invernadero. Más aún, la pérdida del fertilizante aplicado es significativa debido al proceso de nitrificación que ocurre en el suelo y contaminación de las napas de agua con nitratos tóxicos (eutrofización). La fijación biológica de nitrógeno en cambio, ocurre naturalmente y provee una opción sustentable para incrementar la productividad agrícola.Una de las principales fuentes de nitrógeno fijado biológicamente en el sistema agrícola es a través de la simbiosis que ocurre entre los rizobios (término que abarca a los géneros bacterianos: Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium y Allorhizobium) y las leguminosas. Los rizobios son capaces de colonizar en forma específica las raíces de las leguminosas e inducir en ellas órganos especializados, llamados nódulos, donde ocurre la fijación del N2.En distintos países la siembra de leguminosas (soja, lotus, trébol, poroto, etc) se acompaña con la inoculación de sus simbiontes compatibles que a su vez presentan una óptima capacidad de fijación de nitrógeno.Las cepas de rizobios inoculados deben competir con cepas naturales ya existentes en el suelo, las que muchas veces nodulan pero en forma no efectiva. A su vez están sujetas a condiciones extremas de salinidad, anegamiento, desecación, acidez o incluso al efecto tóxico de herbicidas.La obtención de cepas capaces de tolerar las condiciones adversas que caracterizan el suelo en que su huésped es sembrado o de presentar una mayor competitividad para la nodulación frente a las cepas autóctonas o mayor eficiencia en la fijación de nitrógeno es uno de los objetivos finales que se persiguen con el estudio a nivel molecular de la interacción Rhizobium-leguminosa. El glifosato es uno de los herbicidas más usados. Está descripto que tiene una alta eficiencia en el control de malezas con una mínima toxicidad ambiental (Healy-Fried et al., 2007). El blanco de acción de este compuesto es la enzima 5-enolpiruvilshikimato-3 fosfato sintasa (EPSPS). Esta enzima cataliza la sexta etapa del metabolismo del shikimato que está involucrado en la síntesis de diversos compuestos aromáticos entre los que se encuentran distintos aminoácidos (Seinrucken y Amrhein, 1980). Este camino metabólico se encuentra en plantas, hongos, parásitos y bacterias.Actualmente el uso de glifosato en Argentina va acompañado del cultivo de soja y maíz transgénicos que poseen la respectiva enzima resistente al efecto tóxico del glifosato. EPSPS cataliza la transferencia del residuo enol-piruvilo del fosfoenolpiruvato al shikimato 3-P. El glifosato ejerce su acción compitiendo con el sustrato natural por el sitio activo de la enzima. Las EPSPS se dividen en 2 clases de acuerdo a su sensibilidad al glifosato: clase I, formada por las enzimas halladas en todas las plantas y en E. coli y Salmonella, las cuales son sensibles a glifosato y las de clase II, que se encuentran en las Gram+ Staphilococcus aureus, Streptococcus pneumoniae y en Agrobacterium tumefaciens cepa CP4, que resisten altas concentraciones del mismo (Funke et al., 2009). La forma más efectiva de obtener soja transgénica resistente a glifosato es mediante la introducción en la misma del gen que codifica para la EPSPS de Agrobacterium tumefaciens CP4.Si bien el uso de plantas de soja transgénica y la utilización de glifosato como herbicida ha sido muy extendido, existen distintos reportes que indican un efecto negativo del mismo sobre la fijación de nitrógeno aún en plantas resistentes, especialmente cuando se encuentran en condiciones de stress (de Mara et al., 2006, Zablotowicz y Reddy, 2004). Además, se ha visto que este herbicida se acumula en los nódulos (Zablotowicz y Reddy, 2004). Si bien muchas bacterias poseen mecanismos de degradación del mismo (Zablotowicz y Reddy, 2004) esto no ha sido descripto para Bradyrhizobium diazoefficiens.La EPSPS de B. diazoefficiens es sensible a glifosato, especialmente en la cepa USDA 110 que ha sido secuenciada en 2002 (Kaneko et al., 2002). Se ha demostrado que el glifosato inhibe el crecimiento de B. diazoefficiens en concentraciones relativamente bajas (Zablotowicz y Reddy, 2004). Además se describieron efectos negativos sobre el desarrollo del nódulo y sobre la etapa de fijación de nitrógeno en sí.Se encuentran patentadas cepas mutantes de B. diazoefficiens resistentes a glifosato seleccionadas luego de un crecimiento en un medio con determinada concentración de glifosato (US20120266332 A1) u obtenidas por ingeniería genética (US6872562 B2). Las primeras tienen la ventaja que se obtuvieron naturalmente y no contienen elementos genéticos externos pero su tolerancia a glifosato se encuentra limitada a 80 ppm de la droga pura, no se conoce como se modificó el genoma de la bacteria y su forma de obtención es aleatoria en cuanto a que si se adopta la misma metodología a otra cepa de B. diazoefficiens no se asegura la obtención de la misma mutación. Las cepas de B. diazoefficiens patentadas que se obtuvieron por ingeniería genética contienen un gen heterólogo (de Agrobacterium tumefaciens CP4, E. coli o Petunia sp.), previamente modificado de manera de adquirir la capacidad de ser resistente a glifosato (patentes Agrobacterium spp. CP4 (US4940835, US476906, US5094945, US4971908). Esta información ha sido introducida en B. diazoefficiens clonada en un plásmido estable, o integrada al cromosoma de B. diazoefficiens en una región distinta a la correspondiente al gen propio. Esto implica que la bacteria cuenta con un gen resistente y sigue manteniendo el gen original sensible. Los autores de esta patente (US20120266332 A1, Charles A. King y Larry C. Purcell) predicen que no es posible conferir resistencia a glifosato por modificación de uno o pocos nucleótidos en el gen que codifica para la EPSPS del propio Bradyrhizobium.