Vectores baculovirales combinados: exposición superficial de antígenos y transducción de genes para la prevención de la Fiebre Hemorrágica Argentina

MATIAS LUIS PIDRE; MAURO SAPIR; SANTIAGO HAASE; AGUSTÍN URE; RICARDO MARTÍN GÓMEZ; VÍCTOR ROMANOWSKI

Buenos Aires

Congreso; XI Congreso Argentino de Virología II Congreso Latinoamericano de Virología IV Simposio de Virología Clínica II Simposio de Virología Veterinaria ?Dr . José L. La Torre?; 2015

p { margin-bottom: 0.25cm; line-height: 120%; }Losbaculovirus son virus envueltos cuyo genoma consiste en una moléculade DNA doble hebra de entre 80 kpb hasta 180kpb. La estrategiade baculovirus display apunta a la obtención de memoria inmunológicadependiente de baculovirus y se basa principalmenteen la exposición de uno o más epítopes de interés en la forma deun polipéptidoquimérico fusionado a la proteína transmembrana mayoritariade los viriones brotantes, GP64. Con algunas modificacionesesta estrategia permite expresar los genes seleccionadosen células de mamíferos utilizando a los baculovirus recombinantes(recBVs) como vehículos de transducción, permitiendo lageneración de una respuesta celular específica, además de humoral.Deallí nuestro interés en desarrollar un sistema de este tipo para elabordajede la prevención de la fiebre hemorrágica argentina (FHA).Inicialmentese amplificó el gen completo de gp64 por PCR y se clonó el productode amplificación en el vector pCR4-TOPO. Se modificó el gen degp64 por PCR con el objetivo de incorporar sitios de clonado en el marcode lectura de la glicoproteína. Con el fin de desarrollar un sistemarápido y versátil para la obtención de recBVs, se utilizó como materialde partida el vector de transferencia pBAcPak9 del sistema de recombinaciónbAcGOZA. En ese contexto, se clonó el gen modificado degp64 en dicho vector de transferencia. El vector resultante fue denominadopBAcDis. Asimismo, se amplificó por PCR la secuencia completade la subunidad G1 de la glicoproteína de superficie del virusJunín(JUNV). De forma complementaria, se realizó un análisisbioinformático para predecir los sitios de interacción de lasubunidad G1 de JUNV con su receptor y utilizar ese fragmento comoposible inmunógeno. Posteriormente se obtuvo por PCR el fragmentode120 pb (G1PD) predicho in silico. Finalmente, los fragmentos correspondientesa G1 y G1PD fueron clonados en el vector de transferenciagenerado anteriormente.Además,se utilizaron dos construcciones adicionales constituidas por el ORFcompleto de la glicoproteína GPC de JUNV clonada en el vector pBAcPak9,bajo el control del promotor de la poliedrina baculoviral y bajoel control del promotor del gen ie1 de citomegalovirusrespectivamente.Acontinuación, se co-transfectó el DNA del bácmido bAcGOZA y lasconstrucciones plasmídicas mencionadas como complejos formados conlípidos catiónicos. De este modo se obtuvieron los recBVs y se confirmópor PCR la incorporación de los genes heterólogos. Posteriormente,se infectaron células de insecto High Five o células de mamíferoVero (según corresponda) con los recBVs y se evidenció la expresiónde las proteínas recombinantes por SDS-PAGE, western blot, ELISA,inmunofluorescencia y citometría de flujo.Laobtención de estos recombinantes permitirá en el corto y medianoplazo la utilización de los mismos como vectores de vacunación de modelosanimales con el objetivo de desarrollar una alternativa a la vacunaya existente contra la FHA.