VECTORES BACULOVIRALES COMBINADOS: EXPOSICIÓN SUPERFICIAL DE ANTÍGENOS Y TRANSDUCCIÓN DE GENES PARA LA PREVENCIÓN DE LA FIEBRE HEMORRÁGICA ARGENTINA.

MATÍAS LUIS PIDRE; MAURO SAPIR; SANTIAGO HAASE; AGUSTÍN URE; RICARDO M. GÓMEZ; VÍCTOR ROMANOWSKI

Buenos Aires

Congreso; XI CONGRESO ARGENTINO DE VIROLOGÍA 2015 II Congreso Latinoamericano de Virología; 2015

Sociedad Argentina de Virología-Asociación Argentina de Microbiología (AAM)

os baculovirus son virus envueltos cuyo genoma consiste en unamolécula de DNA doble hebra de entre 80 kpb hasta 180kpb. Laestrategia de baculovirus display apunta a la obtención de memoriainmunológica dependiente de baculovirus y se basa principalmente enla exposición de uno o más epítopes de interés en la forma de unpolipéptido quimérico fusionado a la proteína transmembranamayoritaria de los viriones brotantes, GP64. Con algunasmodificaciones esta estrategia permite expresar los genesseleccionados en células de mamíferos utilizando a los baculovirusrecombinantes (recBVs) como vehículos de transducción, permitiendola generación de una respuesta celular específica, además de humoral.De allí nuestro interés en desarrollar un sistema de este tipo para elabordaje de la prevención de la fiebre hemorrágica argentina (FHA).Inicialmente se amplificó el gen completo de gp64 por PCR y se clonó elproducto de amplificación en el vector pCR4-TOPO. Se modificó el gende gp64 por PCR con el objetivo de incorporar sitios de clonado en elmarco de lectura de la glicoproteína. Con el fin de desarrollar unsistema rápido y versátil para la obtención de recBVs, se utilizó comomaterial de partida el vector de transferencia pBAcPak9 del sistema derecombinación bAcGOZA. En ese contexto, se clonó el gen modificadode gp64 en dicho vector de transferencia. El vector resultante fuedenominado pBAcDis. Asimismo, se amplificó por PCR la secuenciacompleta de la subunidad G1 de la glicoproteína de superficie del virusJunín (JUNV). De forma complementaria, se realizó un análisisbioinformático para predecir los sitios de interacción de la subunidadG1 de JUNV con su receptor y utilizar ese fragmento como posibleinmunógeno. Posteriormente se obtuvo por PCR el fragmento de 120pb (G1PD) predicho in silico. Finalmente, los fragmentoscorrespondientes a G1 y G1PD fueron clonados en el vector detransferencia generado anteriormente.Además, se utilizaron dos construcciones adicionales constituidas por elORF completo de la glicoproteína GPC de JUNV clonada en el vectorpBAcPak9, bajo el control del promotor de la poliedrina baculoviral ybajo el control del promotor del gen ie1 de citomegalovirusrespectivamente.A continuación, se co-transfectó el DNA del bácmido bAcGOZA y lasconstrucciones plasmídicas mencionadas como complejos formadoscon lípidos catiónicos. De este modo se obtuvieron los recBVs y seconfirmó por PCR la incorporación de los genes heterólogos.Posteriormente, se infectaron células de insecto High Five o células demamífero Vero (según corresponda) con los recBVs y se evidenció laexpresión de las proteínas recombinantes por SDS-PAGE, western blot,ELISA, inmunofluorescencia y citometría de flujo.La obtención de estos recombinantes permitirá en el corto y medianoplazo la utilización de los mismos como vectores de vacunación demodelos animales con el objetivo de desarrollar una alternativa a lavacuna ya existente contra la FHA.