Desarrollo de una PCR Dúplex para el diagnóstico de la Enfermedad de Aujeszky: Diferenciación entre animales vacunados de naturalmente infectados

SERENA MS; GAVA D; SIMON N; ECHEVERRIA MG; CIACCI-ZANELLA J

Buenos Aires

Congreso; X Congreso Argentino de Virología; 2011

El Herpes virus suino tipo I (SuHV-1) es el agente causal de la Pseudorrabia (PRV). El hospedador natural es el cerdo especie en la cual la infección se manifiesta de diferentes maneras, en individuos adultos causa abortos e infecciones latentes, mientras que en jóvenes resulta letal, y aquellos que superan la enfermedad son considerados portadores latentes, tornándose una fuente de infección cuando el virus es reactivado. La enfermedad está ampliamente difundida y en los países desarrollados esta siendo erradicada mediante la utilización de una vacuna gE-negativa y tests serológicos de control que permiten discriminar animales vacunados de naturalmente infectados. El SENASA retomó la campaña de erradicación (resolución 474/2009) exigiendo cada cuatro meses realizar un seguimiento epidemiológico mediante la detección de anticuerpos por ELISA. A pesar de la especificidad de los test serológicos, la desventaja radica en que dependen de la seroconversión del animal. La utilización de estos test durante la fase aguda de la enfermedad puede llevar a resultados falsos-negativos, ya que es necesario por lo menos 10 días para la detección de anticuerpos específicos. Puede ocurrir que los más jóvenes mueran antes de la seroconversión, siendo no viable el diagnóstico serológico. A su vez, animales portadores del virus pueden presentar disminución del nivel de anticuerpos llevando también a un resultado falso negativo. El objetivo de este trabajo fue desarrollar una PCR Dúplex que permita el diagnóstico diferencial entre animales vacunados e infectados naturalmente, que no pudieron ser discriminados por los test serológicos. Se infectaron células PK15 con cepas vacunales (NIA-4 y Bartha), y con cepas salvajes de SuHV-1 aisladas en el laboratorio de Embrapa Suinos y Aves, Brasil. Luego de observarse el efecto citopatogénico, las células fueron recolectadas para realizar la extracción del ADN viral por la técnica de fenol-cloroformo-isoamílico (25:24:1). La concentración y calidad del ADN fue evaluada midiendo la relación OD260/OD280 en espectrofotómetro. Para el desarrollo de la PCR Dúplex se diseñaron cebadores específicos que amplifican un fragmento del gen gE y uno de gD. Las condiciones de la reacción fueron optimizadas en base a modificaciones de las concentraciones de MgCl2, DMSO, y la temperatura de anillado. La PCR Dúplex fue capaz de diferenciar las muestras vacunales de los aislamientos de campo, observándose solo una banda (217 pb) representando la presencia del fragmento que codifica para gD en las muestras vacunales y un perfil de dos bandas (217 pb y 500 pb) representando la amplificación de los genes gD y gE en el caso de las muestras de campo. Los métodos inmunológicos utilizados para el diagnóstico de la EA están sujetos a resultados falsos negativos cuando los animales están en la fase aguda de la infección o en aquellos animales portadores latentes. En este caso la PCR Dúplex es una buena alternativa para los laboratorios de diagnóstico. Este trabajo se realizó en el marco del convenio existente entre la UNLP y Embrapa Suinos y Aves, Brasil (Acuerdo Básico de Cooperación Científica y Tecnológica 2011).