IGEVET   21075
INSTITUTO DE GENETICA VETERINARIA "ING. FERNANDO NOEL DULOUT"
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
OPTIMIZACION DEL ENSAYO COMETA MEDIANTE LA UTILIZACION DE MICROGELES UNICOS
Autor/es:
CRESPO, ROSANA; MARCOS, RICARD; GARCÍA DE BRAVO MARGARITA Y GÜERCI ALBA
Lugar:
La Plata
Reunión:
Jornada; Jornadas Anules de la Facultad de Ciencias Médicas. UNLP; 2011
Institución organizadora:
Facultad de Ciencias Médicas. UNLP. Secretaria de CyT.
Resumen:
Introducción:
Dentro
de las metodologías utilizadas en el ámbito de la Genética Toxicológica
el Ensayo Cometa es reconocido por su
sensibilidad, simpleza, rapidez y bajo costo. Es ampliamente utilizado para
evaluar el daño genotóxico inducido por distintos agentes, y su atención en mutagénesis y
biomonitoreo ambiental parece incrementarse con el desarrollo de las continuas mejoras
que se van implementando. No obstante, uno de los puntos críticos es la no
uniformidad de la efectroforesis que aporta variabilidad a los resultados y
también por la preparación de los microgeles respectivos. Se propone un nuevo
protocolo como alternativa sencilla y económica a las presentes en punta. El
diseño reside en ubicar la totalidad de las muestras del experimento en un solo gel de manera de compensar la
utilización de materiales costosos (gel bond) y la preparación de geles
individuales para cada punto. Todas las muestras son sembradas dentro del mismo
soporte y por ende se evitan las heterogeneidades consecuentes que pueden ser
importantes al momento de interpretar los resultados considerando la
sensibilidad extrema de la técnica y la variabilidad intrínseca del
procedimiento electroforético.
Objetivos:
Optimización de la versión alcalina del Ensayo de Electroforesis de Células Aisladas (COMETA) mediante la utilización
de geles únicos.
Materiales y métodos:
El diseño fue implementado
sobre diferentes líneas celulares utilizadas frecuentemente en el área de
Genética Toxicológia (CHO-K1; A549;
HepG2 y Jurkat). Se realizó la versión alcalina de la técnica de acuerdo al
método de Singh y colaboradores (1988) con las modificaciones en la preparación
de los geles aludidas previamente en la Introducción. Mediante 5 entradas
experimentales se ajustaron los siguientes parámetros: 1) Volumen de siembra (entre 10 y 25 µl); 2) Número de
puntos por gel (entre 2 y 8), número de células por punto (entre 500 y 10000
células) y relación volumen de suspensión celular/agarosa bajo pto de fusión
(ABPF) (1/3, 1/4, 1/5). Los preparados fueron teñidos con Sybr Green I y/o DAPI y fueron
analizados con un microscopio de fluorescencia Olympus BX51. Las imágenes
fueron jerarquizadas en 6 categorías y clasificadas según su grado de daño en:
0 (sin daño), 1 (daño muy leve), 2 (daño leve); 3 (daño severo), 4 (daño muy
severo) y células muertas (apoptóticas y necróticas). En segunda instancia se
realizó la validación del método, ratificando los resultados obtenidos en
células tratadas con un agente químico inductor de daño genético y sus
respectivos controles, en la versión propuesta de la técnica con la versión convencional. El tratamiento
estadístico se realizó según el test t-student.
Resultados:
El
mejor diseño se obtuvo con un total de 8 puntos por portaobjeto, dispuestos en
dos hileras de 4 puntos cada una. El volumen óptimo de siembra fue de 16 µl finales con 1000 células por
punto y respetando la relación 1:4 (volumen de suspensión celular/ABPF). De
esta manera se logró la individualización de puntos adyacentes y la no
superposición de cometas dentro de los campos de observación. La versión
propuesta fue validada estadísticamente ya que no se observaron diferencias
significativas (p>0.05) entre ambos procedimientos.
Conclusiones:
De acuerdo a los resultados
obtenidos se considera que desde una perspectiva estricta de la exigencia
experimental el protocolo propuesto permitiría eliminar la variabilidad
intergeles, que contribuye muchas veces de manera sustancial a la falta de homogeneidad
efectiva entre los diferentes puntos del diseño experimental. De esta manera se
lograría la optimización de la técnica a través de variables no consideradas hasta
el momento y de suma importancia para la eficacia de la técnica.