Cromatografía de afinidad: desarrollo de una columna de afinidad para el aislamiento y purificación de Lisozima

GONZALEZ UA; FERRARIS M.P.; RAMOS P.D.

San Rafael

Congreso; CLICAP 2018: Congreso Latinoamericano de Ingeniería y Ciencias Aplicadas; 2018

Facultad de Ciencias Aplicadas a la Industria de la Universidad Nacional de Cuyo

El objetivo de este trabajo es la elaboración de una columna de afinidad de lecho fijo con el macroligando CélulaCibacronBlue inmovilizado a geles sólidos para el aislamiento y purificación de Lisozima (Lis).Los macroligandos de afinidad se prepararon a partir de células de levadura modificadas por tratamiento químico conetanol y con la molécula de ligando Cibacron Blue F3GA inmovilizada a la pared celular por unión covalente. Sedeterminó la cantidad de ligando inmovilizado por método espectrofotométrico a 610nm. Se prepararon cubos deagarosa-macroligando por suspensión de 250 mg de macroligando Célula-Cibacron en agarosa al 4%, se dejó enfriar atemperatura ambiente en una película de 2 mm de espesor y finalmente se prepararon los cubos de 2x2x2 mm. Losexperimentos de adsorción de Lis en el equilibrio fueron llevados a cabo en modo batch, el adsorbente fue caracterizadofuncionalmente mediante determinación de la capacidad de adsorción (qm) y constante de afinidad (Kd) en el equilibrio através de isotermas de adsorción (Langmuir y Freundlich). Para determinar el tiempo requerido para alcanzar elequilibrio de Lis sobre el adsorbente, se realizó un estudio cinético de la adsorción; se tomó 1 ml de muestra a intervalosde 30 min y luego a intervalos de 2 horas, seguidamente se determinó la concentración de Lis por espectofotometría a280nm. Se realizaron ensayos de aplicación del macroligando en columna cromatográfica para la separación de Lis apartir de la clara de huevo. Para ello se colocaron los cubos de agarosa-macroligando en una columna de vidrio de 16mm de diámetro y de 20 cm de altura, la cantidad de agarosa-macroligando cubría ¾ partes de la columna. Finalmentese añadieron 15 ml de clara de huevo previamente homogeneizada. Se analizó el grado de recuperación y pureza de laproteína, para ello las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE. Finalmente se determinó la concentración deproteínas mediante espectrofotometría. Los resultados indican que el macroligando Célula-Cibacron posee una elevadacapacidad de inmovilización del ligando (240 μmol de ligando / g de célula). Se realizó un estudio cuantitativo de laadsorción por afinidad de Lis a los cubos de agarosa-macroligando para caracterizar, mediante la determinación deparámetros cinéticos, la eficiencia del adsorbente obtenido. La adsorción en el equilibrio de Lis a los cubos de agarosamacroligandofue descripta por el modelo de Langmuir y los valores de adsorción de qm= 294 mg /g de adsorbente y Kd= 4,11x 10-6 M se calcularon por transformación lineal de la ecuación. La adsorción de Lis es bastante rápida alcomienzo y se logra el equilibrio a la hora de iniciado el proceso, en donde se llega a la saturación del adsorbente. Losresultados de purificación de Lis desde clara de huevo mostraron una significativa cantidad de Lis que es purificada conel sistema cromatográfico de afinidad y con elevada pureza (más del 90%). Usando este modelo, obtuvimos 190 mg deLys / g de adsorbente. No hubo oclusión o bloqueo de la columna de afinidad durante el proceso de separación.