Clonado, expresión y caracterización biocatalítica de AKR3 de Rhodotorula mucilaginosa LSL

JURI-AYUB M; MASCOTTI ML; ANELLO A; KURINA-SANZ M

Montevideo

Simposio; II SILABYB; 2016

UNDELAR

Las aldo-ceto reductasas (AKR) EC 1.1.1.x, constituyen una superfamilia de enzimas que catalizan la oxidorreducción de carbonilos, alcoholes y dobles enlaces C-C [1]. Éstas, han sido clasificadas en 16 familias (AKR1-AKR16) de acuerdo a su historia evolutiva. Su uso en forma aislada presenta muchas ventajas y la sobreexpresión en organismos recombinantes facilita su aplicación en procesos industriales [2].Mediante genome mining y biología molecular, se identificó una AKR de la levadura quimioextremófila Rhodotorula mucilaginosa LSL [3]. Esta enzima fue clonada y sobreexpresada en forma soluble en E.coli y posteriormente purificada por afinidad, con muy buenos rendimientos en ambas etapas. Se comprobó su preferencia por NADPH como cofactor y su baja afinidad por NADH, al igual que la mayoría de las otras AKRs reportadas. Para determinar su perfil de sustratos, se realizó un screening colorimétrico que mostró la preferencia de la enzima por aldehídos aromáticos, como benzaldehído y derivados, y otros compuestos de interés industrial como xilosa y furfural. Se utilizó como sistema de regeneración de NADPH una fosfito deshidrogenasa (PTDH) dependiente de fosfito (ver Figura). Se determinaron los parámetros cinéticos en estado estacionario kcat y KM para los mejores sustratos identificados en el screening y se determinaron conversiones por GC-FID y RMN. La enzima demostró ser muy robusta, presentando muy buena actividad y gran estabilidad a diferentes pHs, principalmente entre 3.6 y 9.0, y en el rango de temperatura entre 19° y 37°C. También se determinó su excelente estabilidad frente al uso de co-solventes.A través de un modelo estructural construido por homología de secuencias, se encontraron los residuos correspondientes a la tétrada catalítica y la estructura de barril TIM, conservados en la superfamilia AKR. El análisis filogenético de su secuencia reveló su cercanía evolutiva con la familia AKR3: AKR de levaduras. La AKR descripta en este trabajo resulta una enzima prometedora para ser aplicada en diversos procesos, ya que presenta muy buena expresión en forma recombinante, es una enzima sencilla de trabajar, es robusta en cuanto a la tolerancia a distintas condiciones de reacción y principalmente presenta una promisoria actividad frente a diversos aldehídos.