PUESTA A PUNTO DE LA TECNICA DE WESTERN BLOT

DI SCIULLO, MARÍA PAULA

2019-01-02/2019-12-20

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Biológica

Salud humana

En esta contribución se presenta la metodología, procedimientos y resultados de la puesta a punto de la técnica de Western Blot (WB) con el objetivo de optimizar la misma para la determinación de las proteínas NF-κB, TNF-α, ERK1 y ERK2 en glándula mamaria, utilizada luego para realizar algunos de los experimentos que formaron parte del trabajo final de Licenciatura en Biología Molecular de María Cecilia Michel, bajo la dirección de la Dra. Emilse Silvina Sánchez y la codirección de la Dra. Silvina Mónica Álvarez, titulado ?Alteraciones Bioquímicas, Celulares y Moleculares en Glándula Mamaria por Contaminación Ambiental con Cadmio. Efectos Dependientes de la Nutrición?, en el Laboratorio de Medicina Experimental y Traduccional dirigido por el Dr. Darío Ramírez durante el 2019. Utilizando muestras procesadas y cuantificadas previamente por la alumna Michel provenientes de homogenatos de glándula mamaria de ratas alimentadas con caseína o soja, que recibieron o no cadmio; se estudiaron los procedimientos de optimización en varios de los pasos. Se evaluaron varios reactivos diferentes en distintas proporciones para la preparación de los geles hasta establecer las cantidades óptimas para el soporte utilizado y lograr así una buena separación de las proteínas. Se establecieron las mejores condiciones de electroforesis y transferencia. Para el análisis de los parámetros de detección se efectuó la técnica de Dot Blot donde se modificaron concentraciones de lisados, soluciones de bloqueo, diluciones de anticuerpos primarios y secundarios, reactivos quimioluminiscentes, entre otros. El revelado se testeó por fluorescencia y por el método quimioluminiscente, examinando la actividad de la enzima peroxidasa HRP en placa radiográfica y por el sistema de revelado Odyssey® Clx de LI-COR y el software Image Studio para el análisis de las imágenes. En este trabajo, se llevaron a cabo las modificaciones iniciales que le permitieron a la alumna realizar las primeras experiencias y obtener algunos resultados en su investigación. No obstante, cabe remarcar que se han encontrado diversas dificultades durante el procedimiento, como el incorrecto funcionamiento de varios de los reactivos o la falta de algunos de ellos para continuar profundizando la optimización del método. A pesar de ello, el WB ha demostrado ser útil en la detección de los marcadores inflamatorios estudiados en muestras de glándula mamaria que necesita un mayor perfeccionamiento del procedimiento.