Caracterización de una enzima adenilil ciclasa en Giardia lamblia

SARAULLO VANINA; ZURITA ADOLFO; DI SIERVI NICOLAS; DAVIO CARLOS

Rosario

Congreso; XXIII CONGRESO LATINOAMERICANO DE MICROBIOLOGÍA XIV CONGRESO ARGENTINO DE MICROBIOLOGIA IV CONGRESO LATINOAMERICANO DE MICROBIOLOGIA DE MEDICAMENTOS ? CLAMME; 2016

Asociación Latinoamericana de Microbiología (ALAM)- Asociación Argentina de Microbiología (AAM)

Introducción: Giardia lamblia (G. lamblia) es un parásito protozoario anaerobio que habita en el intestino delgado de los humanos y otros animales superiores y su infección es la causada más frecuente de diarrea y mala absorción en el mundo. Se ha descripto que proteína kinasa A -inducida por AMPc- estaría involucrado en la regulación del proceso de infección. Sin embargo, hasta la fecha no ha sido caracterizada ningún mecanismo de regulación de AMPc en G. lamblia.Recientemente, mediante un análisis del genoma de G. lamblia, hemos encontrado la secuencia para una enzima con posible actividad adenilil ciclasa (gAC), la cual creemos sería la responsable de la síntesis de AMPc en este parásito. Objetivo: Obtener y caracterizar in vitro la enzima gAC de G. lamblia.Materiales y Métodos:Análisis bioinformático, para la detección de gAC en el genoma de G. lamblia y de estructuras secundarias y terciarias en la enzima gAC.RT-PCR para la detección de ARNm de gAC en G. lamblia.PCR, cultivo de bacterias, Western Blot y cromatografía de afinidad por columnas Ni, para el clonado, expresión y purificación de gAC.Ensayo de síntesis de AMPc in vitro para la caracterización enzimática de gAC y ensayo de desplazamiento de [3H]AMPc para la cuantificación del AMPc sintetizado. Resultados:Luego de identificar la presencia de gAC en el genoma de G. lamblia, un análisis bioinformático posterior, encontró que gAC estaría compuesta por dos dominios transmembrana en su extremo N-terminal y un dominio catalítico en el extremo C-terminal. En función de estos resultados, logramos clonar, expresar y purificar de bacteria dos fragmentos conteniendo el dominio catalítico de gAC a los cuales se les agregó un epítope 6His N-terminal.Estas proteínas purificadas, llamadas 6His-gAC268 y 6His-gAC301, demostraron posteriormente (mediante un ensayo enzimático in vitro) tener actividad adenilil ciclasa dependiente de Mn2+.Paralelamente, mediante un ensayo de RT-PCR, se detectó la expresión de ARNm de gAC en trofozoítos de G. lamblia incubados in vitro.Conclusiones: Los resultados obtenidos sugieren, que la enzima gAC se expresa constitutivamente en G. lamblia y que, a su vez, sería la responsable de la síntesis de AMPc en este parásito.