CONICET | Buscador de Institutos y Recursos Humanos

Numerosos microorganismos infectan células fagocíticas como los macrófagos. Estos patógenos se mantienen viables en el interior de estas células e inclusive se multiplican. En la fagocitosis, una forma especializada de endocitosis, se conocen ya varios factores que podrían ser el blanco de las alteraciones provocadas por estos parásitos. En nuestro laboratorio hemos elaborado protocolos que nos permiten seguir a Brucella abortus durante su tráfico intracelular hasta su digestión. Las proteínas Rabs juegan roles importantes en la regulación del transporte vesicular, a través de mecanismos de fusión-fisión de membranas. Entre las Rabs, se destaca Rab11, localizada en fagosomas tempranos. En este trabajo nos propusimos evaluar la función de la proteína Rab11 (Imagen 1) en una línea celular de macrófagos, Raw 267.4, que sobreexpresan esta proteína unida a una etiqueta fluorescente verde (GFP-Rab11WT). Se estudió la biogénesis y maduración de fagosomas en macrófagos infectados con diferentes cepas de Brucella abortus y tratados con inhibidores de kinasas, tales como: Wortmanina, un inhibidor de la fosfatidil-inositol-3-kinasa (PI-3K) y AKTi, un inhibidor de la kinasa (AKT) que favorece la unión de Rab11 a GTP. MATERIALES Células: Como modelo de células fagocíticas profesionales se utilizó la línea celular de macrófagos Raw 264.7 transfectadas con GFP-Rab11WT y sin transfectar. Bacterias: Se utilizaron las siguientes cepas de Brucella abortus: la virulenta para humanos identificada como 2308 y las cepas vacunales de virulencia atenuada S19 (cepa lisa) y RB51 (cepa rugosa). Transfección de línea celular de macrófagos Raw: Los macrófagos (5 X 105) fueron transfectados con 1µg de DNA plasmídico (pGFP-Rab11WT) utilizando el reactivo LipofectAMINE 2000 (Gibco BRL) de acuerdo a sus especificaciones. Se seleccionaron los clones que expresan la proteína GFP-Rab11WT por su resistencia a 0,5 mg/ml del antibiótico geneticina (Imagen 3). Fagocitosis: Para estudiar el rol de esta proteína durante el proceso de internalización y a lo largo de la vía fagocítica. Se realizaron ensayos de fagocitosis de partículas de latex marcadas con rhodamina y la marcación de compartimentos subcelulares utilizando diferentes marcadores fluorescentes. Se requirió para este trabajo la utilización de microscopía de fluorescencia de última generación y microscopía confocal, para lo cual se dispuso de un microscopio confocal Olympus FV1000 montado sobre un microscopio invertido con objetivo 100X 1.4 equipado con software para la adquisición y análisis de imágenes (Imagen 2). Para estudiar el efecto de los inhibidores de kinasas: wortmanina y AKTi en macrófagos infectados con las diferentes cepas de Brucella abortus, se realizaron ensayos de recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) a diferentes períodos de incubación. Para ello, se resuspendieron las cepas de Brucella abortus (2308, S19 y RB51) en 50 µl de BME a 4 ºC, y se procedió a infectar los macrófagos. Se centrifugaron las placas de cultivo a 1000 rpm a temperatura ambiente durante 30 min, para favorecer la adhesión de las bacterias a los macrófagos. Para permitir la internalización, se colocaron las placas a 37 ºC con tensión de CO2 durante 30 min. Se lavaron para eliminar todas las bacterias extracelulares. Se agregaron los inhibidores de kinasas a una concentración de trabajo de: Wortmanina 20 nM y AKTi 210 µM. Se incubaron a 37 ºC con tensión de CO2 durante 14 h. Luego de sucesivos lavados, se levantaron las células y se sonicaron para liberar las bacterias. Se sembraron diluciones en placas de agar para promover el crecimiento de las bacterias y posteriormente realizar el recuento de UFC de cada una de las cepas ensayadas. RESULTADOS Se confirmaron los resultados obtenidos previamente utilizando células HeLa (fagocitos no profesionales) que sobreexpresaban en forma transiente la proteína GFP-Rab11WT e infectadas con las diferentes cepas de Brucella abortus. Las cepas vacunales S19 y RB51, así como la cepa virulenta 2308 de Brucella reclutan a Rab11WT al fagosoma que la contiene, al igual que a la mutante activa unida permanentemente a GTP, Rab11Q70L. Luego se analizó el efecto de los inhibidores de kinasas en la multiplicación y sobrevida intracelular de este patógeno cuando infecta macrófagos Raw. Se analizó el efecto a diferentes tiempos postinfección (p.i.). En la tabla de la Imagen 4 podemos observar el efecto de los inhibidores de kinasas en macrófagos infectados con las diferentes cepas de Brucella abortus a las 14 horas p.i. Se ha descrito que PI-3K regula la fusión entre fagosomas y su acidificación por un mecanismo dependiente de AKT. La kinasa AKT fosforila a la GAP (GTPase Activating Protein) de Rab11 y la inactiva, esto promueve que Rab11 permanezca unida a GTP. El inhibidor de AKT, AKTi, provoca el efecto contrario, o sea que favorece la hidrólisis de GTP, inactivando a Rab11 (forma unida a GDP). Este inhibidor de kinasas, AKTi, no modificó en forma significativa el crecimiento de las diferentes cepas de Brucella abortus analizadas en las concentraciones utilizadas ni en los períodos postinfección estudiados, aunque mostró una tendencia a disminuir la replicación de las cepas vacunales. Por el contrario, el inhibidor de la fosfatidil-inositol-3-kinasa, Wortmanina, aumentó sensiblemente la replicación bacteriana de la cepa vacunal rugosa RB51 y ligeramente el de la cepa vacunal lisa S19, sin modificar el crecimiento de la cepa virulenta 2308. Estos resultados implican que las cepas de Brucella abortus poseen una diferente sensibilidad a la falta de inositoles-3-fosfato, compuestos requeridos para la biogénesis y maduración de fagosomas. Nuevos experimentos se han diseñado para dilucidar la participación de estas kinasas en la maduración de los fagosomas que contienen diferentes cepas de Brucella abortus.