Diacilglicerol induce la reacción acrosomal en espermatozoides humanos mediante la activación de RASGRP1 en ausencia de calcio y AMPc

ALTAMIRANO KN; BELMONTE SA; LUCHESI O; RUETE MC

Mendoza

Jornada; VIII Jornadas de bioquímica y biología molecular de lípidos y lipoproteínas; 2019

El espermatozoide contiene un gran gránulo secretorio (acrosoma) que exocita frente adiferentes estímulos. Este proceso se denomina reacción acrosomal y es requerido para queocurra la fertilización. Nuestro laboratorio demostró que el diacilglicerol (DAG) estimula laexocitosis acrosomal induciendo un ciclo de retroalimentación positiva dependiente de PKC yfosfolipasa D1 (PLD1) que provee continuamente fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2).Llamativamente, DAG es capaz de inducir la exocitosis en ausencia de calcio extracelularactivando dos vías de señalización, una que conduce a la síntesis de IP3 y salida de calcio delreservorio acrosomal, y otra que conduce a la activación de Rab3A y ensamble de las SNAREs.El módulo de señalización cAMP/Epac/Rap1/PLCε/IP3 moviliza calcio del acrosoma durante laexocitosis del espermatozoide. Hasta ahora se ha descripto que en espermatozoides humanosEpac (exchange protein directly activated by cAMP) activa la pequeña GTPasa Rap1. Nosotrospostulamos una vía alternativa donde DAG podría también activar la Rap1 a través de un GEF(factor intercambiador de nucleótidos, RasGRP1). Rap1-GTP entonces activaría PLCƐ sin lanecesidad de cAMP y Epac. Utilizando la esponja de cAMP permeable a membranas,secuestramos el cAMP endógeno y luego agregamos DAG. El DAG indujo exocitosis enausencia de cAMP. Usando FAR-immunofluorescence demostramos que DAG es capaz deactivar Rap1. Mediante Western blot usando anticuerpos específicos, demostramos lapresencia de una proteína de 81 kDa, RasGRP1, y por inmunofluorescencia indirectadeterminamos que se localizaba en la región acrosomal de espermatozoides humanos. Paraestudiar el efecto de dicha proteína en la RA realizamos ensayos de exocitosis acrosomaldonde evaluamos la pérdida del acrosoma mediante la tinción con lectina de Pisum sativumacoplada a FITC. Las células se contaron en un microscopio de fluorescencia o por citometríade flujo. Incubamos espermatozoides permeabilizados con el anticuerpo específico contraRasGRP1 y observamos que a una concentración de 70 nM el anticuerpo bloqueó la exocitosisinducida por DAG. Para estudiar en profundidad el efecto de RasGRP1 en la exocitosis, seprodujo la proteína recombinante GST-RasGRP1. Agregamos la proteína en dosis crecientes25-40 nM a gametas permeabilizadas y observamos que éste factor es capaz de inducirreacción acrosomal produciendo un efecto máximo a 35 nM. Mediante ensayos funcionalesdeterminamos que al secuestrar DAG con el dominio C1 de Munc13-1 (1μM) se inhibiósignificativamente la exocitosis acrosomal estimulada por RasGRP1. En este trabajopresentamos evidencia directa de la presencia y función de un factor intercambiador denucleótidos de guanina (RasGRP1) activado por DAG en espermatozoides humanos. En estetrabajo, proponemos una nueva vía de activación de Rap1 durante la exocitosis acrosomal.