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Cambios bioquímicos y morfológicos en mastocitos humanos expuestos a lactonas naturales α,β-insaturadas Introducción: Los mastocitos son células secretoras altamente especializadas que participan en las respuestas inmunes innatas y adaptativas. Están asociados al desarrollo de patologías como anafilaxis, atopia, rinitis, úlcera gastroduodenal, síndrome de colon irritable, migraña, esclerosis múltiple y desarrollo tumoral. La activación mastocitaria se produce por agregación de receptores de alta afinidad para IgE (FceRI). Estas células también pueden ser activadas por estimulación de proteínas G, inducibles por secretagogos básicos, como compuesto 48/80. Ambas vías de señalización convergen en el aumento de calcio citoplasmático, resultando en la síntesis y/o liberación de mediadores de la inflamación. Los mediadores preformados, como serotonina, histamina y enzimas (triptasa, quimasa, β-hexosaminidasa), se almacenan en gránulos citoplasmáticos, que son liberados por exocitosis (degranulación). Los mediadores de nueva síntesis incluyen citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento y productos del metabolismo del ácido araquidónico. La línea celular LAD2 deriva de un paciente con sarcoma/leucemia de mastocitos humanos y posee características fisiológicas y morfológicas similares a los cultivos de mastocitos humanos. En trabajos previos hemos demostrado que deshidroleucodina (DhL), lactona sesquiterpénica aislada de Artemisia douglasiana Besser (matico) y xantatina (Xt), xantanólido sesquiterpeno aislado de Xanthium cavanillesii Schouw (cadillo), inhiben la degranulación de mastocitos peritoneales de rata inducida por compuesto 48/80 y por ionóforo de calcio A23187. DhL y Xt son lactonas α,β-insaturadas, obtenidas por nuestro grupo de trabajo durante investigación extensiva en el desarrollo de moléculas con actividad antiulcerosa. El presente estudio fue diseñado para probar la hipótesis que DhL y Xt inhiben la degranulación de células LAD2 inducida por 48/80 o A23187. Métodos: Cultivo celular: la línea LAD2 se mantuvo en cultivo en medio StemPro-34 suplementado, en estufa a 37°C en atmósfera con 5% de CO2. Protocolo general: Se determinó la viabilidad y densidad celular de las células LAD2 colectadas del cultivo mediante prueba de exclusión de azul Tripán. Se incubaron alícuotas de suspensión celular en placas de 96 pocillos a 37°C, en presencia de DhL y Xt, previo a la incubación con 10µg/ml de 48/80 o 10µg/ml A23187. Se realizaron curvas dosis-respuesta (concentraciones de DhL o Xt de 10, 50 y 100 μM) y tiempo-respuesta (incubación con DhL o Xt por 10, 30 y 60 minutos). Se realizó estudio comparativo con cromoglicato de sodio (Crgl), un clásico estabilizador de mastocitos. Se separó el sobrenadante de las células por centrifugación y se determinó el porcentaje de β-hexosaminidasa liberada. Los sedimentos se lisaron con tritón X-100 al 1% para liberar la β-hexosaminidasa remanente. La actividad β-hexosaminidasa se determinó por reacción colorimétrica utilizando el reactivo cromogénico p-nitrofenil N-acetil-β-D-glucosaminida. Otras muestras de sedimentos celulares se utilizaron para ensayos de viabilidad celular por prueba de exclusión de azul Tripán o se fijaron para microscopía óptica o microscopía electrónica de barrido o microscopía electrónica de transmisión. Análisis estadístico: los resultados se analizaron utilizando análisis de la varianza seguido por la prueba de comparaciones múltiples de Tukey-Kramer. Los resultados de los análisis bioquímicos se presentan como la media ± S.E.M. P≤0.05 se consideró estadísticamente significativo. Resultados Figura 1a y 1c: Curvas dosis-respuesta. Porcentaje de β-hexosaminidasa liberada luego de la incubación de LAD2 con concentraciones crecientes de DhL o Xt, previo a la incubación con 48/80 (a) o A23187 (c). En la figura 1a se observa un aumento estadísticamente significativo en la liberación de β-hexosaminidasa entre el grupo tratado con 48/80, DhL 10µM+48/80 y el grupo control (liberación basal). DhL 50 y 100µM y Xt 50 y 100µM inhibieron la liberación de β-hexosaminidasa inducida por 48/80. La figura 1c muestra incremento estadísticamente significativo entre el grupo estimulado con A23187, DhL 10, 50 o 100µM+A23187, Xt 10µM+A23187 y grupo control. Se observa inhibición de la liberación de β-hexosaminidasa cuando las células LAD2 fueron incubadas con 100µM de Xt previo a la estimulación con A23187. Figura 1b y 1d: Efecto tiempo-respuesta de DhL y Xt sobre la liberación de β-hexosaminidasa por LAD2. Las células fueron incubadas con DhL o Xt 100μM por períodos de tiempo crecientes (10, 30 y 60 minutos) y estimuladas con 48/80 (b) o A23187 (d). Figura 1e: Efecto de DhL y Xt sobre la liberación de β-hexosaminidasa comparado con Crgl. Las células LAD2 se preincubaron con 100µM de DhL, Xt o Crgl y fueron estimuladas con 48/80 o A21187. Los resultados se expresaron como porcentaje de β-hexosaminidasa liberada. Figura 2: Microscopía Óptica. Control: el citoplasma contiene gránulos secretorios metacromáticos. 48/80 y A23187: se observan procesos de degranulación extensiva y la presencia de gránulos liberados. DhL+48/80, Xt+48/80, DhL+A23187, Xt+A23187: morfología similar al grupo control. Figura 3: Microscopía Electrónica de Barrido. Control: células caracterizadas por forma redondeada y protrusiones proyectándose desde la superficie. 48/80 y A23187: células con formas irregulares presentando evidencias de descarga granular. DhL+48/80, Xt+48/80, DhL+A23187, Xt+A23187: morfología similar al grupo control. Figura 4: Microscopía Electrónica de Transmisión. Control: se observa núcleo irregular no segmentado, pliegues angostos superficiales y numerosos gránulos secretorios en citoplasma. 48/80 y A23187: población granular reducida cuando se compara con células del grupo control. Se evidencian gránulos rodeados de espacios perigranulares dilatados y electrón-lúcidos. Algunos de estos espacios se encuentran fusionados, formando numerosas cavidades y canales intracitoplasmáticos. DhL+48/80, Xt+48/80 y Xt+A23187: estas células muestran mínima degranulación y sus características morfológicas y distribución de los gránulos son similares al grupo control. DhL+A23187: se observan características morfológicas y distribución citoplasmática de los gránulos intermedias entre el grupo control y el grupo A23187. CONCLUSIONES Deshidroleucodina y xantatina inhiben la activación de mastocitos inducida por compuesto 48/80 en forma dosis- y tiempo-dependiente. Xantatina inhibe la activación mastocitaria estimulada por ionóforo de calcio A23187 de manera dosis y tiempo dependiente. No se observaron cambios en células tratadas con deshidroleucodina más ionóforo de calcio A23187. Los efectos inhibitorios de deshidroleucodina y xantatina sobre la liberación de b-hexosaminidasa fueron mayores a los obtenidos con el compuesto de referencia, cromoglicato de sodio, cuando las células LAD2 fueron estimuladas con compuesto 48/80. Deshidroleucodina y xantatina actúan como estabilizadores mastocitarios en la línea de mastocitos humanos LAD2 y podrían representar nuevas alternativas terapéuticas para el tratamiento de patologías asociadas con activación mastocitaria.