La proteína TAT del HIV inhibe la secreción del granulo acrosomal inducida por progesterona en espermatozoides humanos

MASONE, DIEGO; ALTAMIRANO, KARINA N; BEAUMELLE, BRUNO; BELMONTE SILVIA A; PACHECO GUINAZU, ANAHI BELEN; RESA JURIN, LUCAS ARMANDO

San Luis

Jornada; VII Jornadas de Bioquímica y Biología Molecular de lípidos y lipoproteínas; 2017

Universidad Nacional de San Luis- IMIBIO (CONICET)

La proteína Tat del HIV1 es una proteína básica de 11kDa esencial para la transcripción activa del virus. Aunque carece de una secuencia señal para ser secretada, es activamente liberada por las células infectadas [1]. El mecanismo de secreción de la proteína no se conoce con exactitud, pero se ha demostrado que Tat se une específicamente al PIP2 de la membrana, a través de un dominio básico que reconoce una sola molécula de PIP2 y se estabiliza por la inserción de la cadena lateral del triptófano 11. Esta interacción guarda una afinidad tan elevada que perturba la posibilidad de reclutamiento de otras proteínas de unión a PIP2. La proteína Tat circulante en el suero de pacientes con HIV alcanza concentraciones nanomolares y es capaz de ingresar a células no infectadas afectando su fisiología [2]. Esta proteína contribuye a la patogénesis del HIV-1 de diferentes maneras: en células cromafines inhibe la neurosecreción debido a que se une e impide la función de PIP2. Disfunciones motoras o cognitivas, cambios de comportamiento, y demencia han sido observados en los pacientes que poseen HIV-1; dado que Tat cruza la barrera hematoencefálica, se cree que podría ser en parte, la responsable de la neuropatogénesis observada. Por otro lado la infección por HIV en hombres induce inflamación leve del tracto genitourinario y fertilidad reducida, los pacientes con HIV que recurren a técnicas de fertilización asistida tienen una tasa de éxito solo del 50% en los procedimientos de fertilización. Además, algunos parámetros de calidad del semen como la integridad del DNA y la reducción de la motilidad difieren de los parámetros normales [3] pudiendo verse afectada la capacidad fertilizante del espermatozoide. Uno de los eventos requeridos para que el espermatozoide pueda fertilizar es la reacción acrosomal. Ésta es una exocitosis regulada, calcio dependiente, que debe ser inducida por un estímulo exocítico fisiológico o farmacológico. Nuestro grupo de investigación ha descripto que luego de este estímulo, se desencadena un loop que retroalimenta la síntesis de PIP2, siendo este fosfolípido fundamental en el proceso de exocitosis del gránulo acrosomal [4]. En este estudio nos proponemos evaluar si la proteína Tat del HIV-1 por su capacidad de ser secretada por las células infectadas, de ingresar a través de las membranas intactas de células no infectadas y de unirse a PIP2, bloqueando su función, puede afectar la exocitosis acrosomal de espermatozoides humanos y por lo tanto su capacidad fertilizante en pacientes portadores del virus. Para el desarrollo experimental se utilizó la isoforma de 86 residuos de la proteína TatWT (wild type) recombinante, y dos variantes mutadas en secuencias específicas: TatW11Y y Tat(49-51)A mutada en un dominio de unión a fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2). En primera instancia, evaluamos si Tat era capaz de ingresar al espermatozoide humano. Incubando las células con la proteína TatWT, por Western blot (WB) (fig1) e inmunofluorescencia indirecta (IFI) (datos no mostrados) logramos determinar que esta proteína era internalizada por las gametas a muy baja concentración (10nM fig1A). El mismo tratamiento se realizó con la mutante TatW11Y la cual no fue internalizada, ni logró unirse a la membrana de la gameta (datos no mostrados). Por simulación computacional descubrimos que la tracción hacia el centro de la membrana del estado TatWT frente al estado TatW11Y, es un evento termodinámicamente más favorable, lo que confirma la relevancia del residuo W11 en el anclaje de Tat a membrana. Para evaluar el posible efecto de Tat sobre la reacción acrosomal (RA) de espermatozoides humanos inducida por progesterona (Pg), incubamos las gametas con Tat o sus mutantes durante 2 hs y luego realizamos ensayos de exocitosis. Observamos que la proteína TatWT inhibe la RA inducida por Pg (**p≤0.01) (fig2A), mientras que la mutante Tat(49-51)A incapaz de unir PIP2, ingresa a las gametas (fig1B) sin ejercer efecto alguno (fig2B). La mutante TatW11Y que no fue capaz de ingresar al espermatozoide, tampoco ejerció efecto sobre la RA (datos no mostrados). A su vez la inhibición de la proteína Tat sobre la RA fue rescatada por la adición de PIP2 (datos no mostrados). Estos resultados demuestran que Tat afecta la RA y que la interacción de esta proteína con PIP2 es clave en este proceso. Este aporte contribuye en gran medida a la investigación en salud reproductiva humana de pacientes hombres seropositivos.