COMPARACIÓN DE DOS METODOLOGÍAS DE EVALUACIÓN PARA VALORAR LA REACCIÓN ACROSOMAL EN ESPERMATOZOIDES HUMANOS.

PELLETÁN LE; MARTINEZ A; FORNES ML; DE BLAS GA; ARIAS RJ

Mendoza

Jornada; V Jornadas Bioquímica de Cuyo; 2018

Asociaciones Bioquímicas

La fecundación es un proceso en el cual se requiere la interacción entre los gametos masculinos y femeninos, maduros y competentes, para que éstos se fusionen y formen un nuevo individuo. Para que esta ocurra, el espermatozoide debe sufrir la reacción acrosomal (RA). La RA es un evento exocítico, calcio dependiente, un proceso especializado de fusión que ocurre en múltiples puntos entre la membrana acrosomal externa y la membrana plasmática originando la liberación de las enzimas almacenadas en la vesícula acrosomal, formación de vesículas mixtas y la exposición de la membrana acrosomal interna (1). Muchos métodos se han descripto para detectar el estado acrosomal de los espermatozoides, la lectina Pisum sativum aglutinina marcada con isotiocianato de fluresceína (PSA-FITC) (2), microscopía electrónica (3), citometría de flujo con los anticuerpos anti-CD46 (4) o anti-GB24 (5), entre otras. Estas técnicas son en general complicadas y costosas. El objetivo de este trabajo fue determinar la sensibilidad y especificidad del azul de Coomassie (AC) para evaluar la RA en espermatozoides humanos, además comparar y correlacionar los resultados obtenidos con la tinción de referencia más utilizada en la actualidad, la lectina PSA-FITC. Se utilizaron muestras de semen de pacientes aparentemente sanos con los parámetros seminales normales según lo establecido por la Organización Mundial de la Salud (6); de pacientes teratozoospérmicos y por último muestras seminales criopreservadas. Las muestras se obtuvieron por masturbación, después de una abstinencia sexual de 2 a 3 días. A cada muestra de semen se le realizó un swim up para separar la fracción vital y se los capacitó durante 3 hs a 37ºC/5% O2C en medio HTF suplementado con BSA, además se les determinó el porcentaje de reacción acrosomal espontánea (sin inducción, control) y el porcentaje de reacción acrosomal inducida por el ionóforo de calcio (A23187, 10 ) y progesterona (Pg, 15 ). Aproximadamente 1 x 105 espermatozoides fueron lavados dos veces en buffer fosfato salino (PBS) y sembrados sobre portaobjetos. Dos portaobjetos se fijaron con metanol frío/30 segundos e incubados con la lectina PSA-FITC a una concentración de 50 gml en PBS durante 30 minutos en cámara húmeda, a temperatura ambiente y oscuridad (7). Luego se lavó con agua destilada durante 20 min. Otros dos portaobjetos fueron teñidos con azul de coomassie fresco durante 1 minuto (0.22% de coomassie Brillante Blue G250 en 50% metanol, 10% ácido acético glacial y 40% agua). Luego se lavó con agua destilada para eliminar el excedente del AC. Luego del último lavado en las dos tinciones, se dejaron secar los portas al aire y se observaron con microscopía de fluorescencia (PSA-FITC) y de transmisión (AC) con objetivo 60X de inmersión. Los estudios mostraron un aumento en el número de espermatozoides reaccionados al estimularlos con ionóforo de calcio como con progesterona comparado con el porcentaje de espermatozoides que presentaron reacción acrosomal espontánea para todas las muestras utilizadas (normales, criopreservadas y teratoozospérmicas). Los rangos de porcentajes absolutos obtenidos por microscopía de fluorescencia fueron para muestras normales 6-13% control, 35-54% A23187, 22-29% Pg); para muestras criopreservadas 6-9% control, 45-50% 23187, 16-18% Pg; para muestras teratozoospérmicas 8-9% control, 49-52% A23187, 18-19% Pg; asimismo los rangos obtenidos por microscopía de transmisión fueron para muestras normales 4-11% control, 38-51% A23187, 17-22% Pg); para muestras criopreservadas 5-8% control, 40-51% 23187, 16-19% Pg; para muestras teratozoospérmicas 8-11% control, 47-53% A23187, 18-23% Pg. Observamos que no existen diferencias significativas en los porcentajes de RA obtenidos en las diferentes condiciones experimentales (control, estimulados con A23187 o con Pg) teñidos con la lectina PSA-FITC como con el AC. Además encontramos una alta correlación entre ambas coloraciones en todas las muestras estudiadas, por lo que proponemos a la tinción de AC como un método confiable para evaluar la RA en espermatozoides humanos, además presenta las ventajas de ser un método rápido, reproducible y de bajo costo, lo que permite su uso en laboratorios bioquímicos de baja complejidad. 1. Yanagimachi R. Fertilization in Mammalian. Knobil E NJ, ed. The Physiology of Reproduction. New York: Raven Press Ltd., 189?318, 1994.2. De Blas G.A., Darszon A., Ocampo A.Y., Serrano C.J., Castellano L.E., Hernández-González E.O., Chirinos M., Larrea F., Beltrán C., Treviño C.L. TRPM8, a versatile channel in human sperm. PLoS One. Jun 30;4(6):e6095, 2009.3. Sosa C.M., Pavarotti M.A., Zanetti M.N., Zoppino F.C., De Blas G.A., Mayorga L.S. Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis. Mol Hum Reprod. Mar; 21(3):244-54, 2015.4. Jaiswal B.S.; Eisenbach. M.; Tur-Kaspa I. Detection of partial and complete acrosome reaction in human spermatozoa: which inducers and probes to use?. Mol. Hum. Reprod., 5: 214, 1999.5. Fierro R.; Foliguet B.; Grignon G. y cols. Lectin-binding sites on human sperm during acrosome reaction: modifications judged by electron microscopy/flow cytometry. Arch. Androl., 36: 187, 1996.6. WHO Laboratory Manual for the Examination and processing of Human Semen. Fifth Edition. 2010.7. Mendoza C., Carreras A., Moos J. and Tesarik J. Distinction between true acrosome reaction and degenerative acrosome loss by a one-step staining method using Pisum sativum agglutinin. J. Reprod. Fertil. 95, 755-63, 1992.