Analisis celular y molecular de la asociación de VP3, proteína multifuncional del virus de la bursitis infecciosa aviar, con compartimentos endocíticos.

GIMENEZ MARÍA CECILIA; COLOMBO MARÍA ISABEL; DELGUI LAURA RUTH; ZANETTI FLAVIA

Rosario, Santa Fe

Congreso; XXIII CONGRESO LATINOAMERICANO DE MICROBIOLOGÍA; 2017

Sociedad Argentina de Microbiología

MI‐0681Analisis celular y molecular de la asociación de VP3, proteína multifuncional del virus de la bursitis infecciosa aviar, con compartimentosendocíticos.MC Gimenez1,4, FA Zanetti2, JF Rodríguez3, MI Colombo1,4, LR Delgui1,4, 51Instituto de Histología y Embriología Mendoza (UNCuyo‐CONICET), Argentina. 2Centro de Ciencia y Tecnología Dr. César Milstein (CONICET).Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina, Argentina. 3Centro Nacional de Biotecnología‐CSIC, Madrid, España. 4Facultad de Farmacia yBioquímica, Universidad Juan Agustín Maza, Mendoza, Argentina. 5Facultad de Ciencias Exactas y Naturales ‐ UNCuyo. Mendoza, Argentina.El Virus de la Bursitis Infecciosa Aviar (IBDV), agente etiológico de la Enfermedad de Gumboro,es un virus desnudo de simetría icosaédrica, cuyogenoma está constituido por ARN de doble cadena. La proteína viral VP3, cumple diversas funciones en su ciclo de infección, siendoprotagonista del proceso de replicación. Antecedentes de nuestro laboratorio indican que VP3, tanto en el contexto de la infección como sobreexpresadaen las células, se asocia a compartimentos membranosos con características endo‐lisosomales no degradativos. Estoscompartimentos actúan como plataforma para el establecimiento de los complejos de replicación viral.Nuestro objetivo fue abordar la caracterización molecular y celular de la asociación de VP3 a los compartimentos endosomales. En primer lugar,realizamos un análisis detallado de la asociación de VP3 a los compartimentos endosomales mediante microscopía confocal empleando célulasaviares que sobre‐expresaban una mutante permanentemente activada de la proteína Rab5 fusionada a EGFP (EGFP‐Rab5Q69L). Rab5 es unaproteína residente en endosomas tempranos y la mutante empleada genera compartimentos de gran tamaño que facilitan el análisis de ladistribución de VP3, en el contexto de la infección o luego de su sobre‐expresión.Posteriormente, con el objetivo de conocer los residuosaminoacídicos que median la asociación, estudiamos el efecto de mutaciones puntuales en la secuencia de la proteína viral VP3, en relación a sucapacidad para asociarse a los compartimentos endosomales empleando para ello marcadores de estas estructuras y microscopía confocal.Finalmente, para determinar la topología de la asociación de VP3 a dichos compartimentos, empleamos la metodología de permeabilizaciónselectiva y diferencial a partir de la utilización del compuesto digitonina, reactivo que en determinadas condiciones es capaz de permeabilizarselectivamente la membrana plasmática, sin interferir en la integridad de las restantes membranas intracelulares.Observamos que VP3 se asocia de manera discontinua, en forma de ?parches?, a los compartimentos marcados con EGFP‐Rab5Q69L. Además,determinamos que ciertas mutaciones puntuales en la secuencia de VP3 eliminan su capacidad de asociación a los compartimentosendosomales, identificando el dominio de VP3 involucrado en dicha asociación. Finalmente, hemos determinado la topología de la asociación deVP3, observando que la misma se encuentra en la cara citosólica de los compartimentos endosomales.Hemos definido la morfología de localización y orientación de VP3 en las plataformas de replicación asociadas a compartimentos endosomales.Además, hemos identificado los residuos aminoacídicos que median la asociación de VP3 a dichos compartimentos.Estos resultados constituyenun importante aporte al campo de los Birnavirus ya que hasta el momento, el nuestro es el único estudio tendiente a dilucidar de formadetallada la estrategia de replicación empleada por los miembros de la familia Birnaviridae.