IHEM   20887
INSTITUTO DE HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA DE MENDOZA DR. MARIO H. BURGOS
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Inmunolocalización de MARCKS por crioultramicroscopía en espermatozoides humanos
Autor/es:
RODRIGUEZ PEÑA, MARCELO J; FADER, CLAUDIO M; CASTILLO, JIMENA V; MAYORGA, LUIS S; MICHAUT, MARCELA A
Lugar:
Rosario, Santa Fe, Argentina
Reunión:
Congreso; 10th InterAmerican Congress of Electron Microscopy 2009 (CIASEM 2009). 1st Congress of the Argentine Society of Microscopy; 2009
Institución organizadora:
Interamerican Committee of Societies for Electron Microscopy y Sociedad Argentina de Microscopia
Resumen:
La cabeza del espermatozoide de mamífero contiene un gran y único gránulo secretorio “el acrosoma”. Este gránulo se encuentra delimitado por la membrana acrosomal externa, próxima a la membrana plasmática, y la membrana acrosomal interna, próxima al núcleo del espermatozoide. Cuando el espermatozoide contacta la zona pellucida del ovocito, se desencadena la exocitosis acrosomal, proceso esencial para la fecundación. Una de las características más llamativas de esta exocitosis, es la fusión en múltiples puntos entre la membrana acrosomal externa y la membrana plasmática. Estas múltiples fusiones originan vesículas híbridas y la liberación del contenido acrosomal [1]. Se sabe que Proteína kinase C (PKC) cumple un papel esencial en la exocitosis acrosomal [2], sin embargo se desconoce las proteínas target para dicha kinasa. MARCKS, acrónimo de Myristoylated Alanine-Rich C Kinase Substrate, es el principal sustrato de PKC en distintos tipos celulares. MARCKS interacciona con las membranas a través de su región N-terminal y por el dominio efector. Este dominio efector contiene cuatro residuos de serina que son fosforilados por PKC. Cuando no está fosforilado, puede unir calmodulina con alta afinidad, entrecruzar filamentos de actina, o secuestrar PIP2 en las membranas. En la mayoría de los casos, la fosforilación del dominio efector resulta en la pérdida de estas actividades y la translocación de la proteína desde la membrana al citosol [3]. Resultados obtenidos en nuestro laboratorio muestran que MARCKS está presente en espermatozoides humanos y localiza principalmente en la región acrosomal y en la cola. MARCKS ha sido involucrada, entre otros, en procesos exocíticos y en motilidad celular, sin embargo se desconoce su mecanismo de acción. La presencia de MARCKS en la región acrosomal nos sugirió su participación en la exocitosis acrosomal. Haciendo uso del modelo de espermatozoides permeabilizados con estreptolisina O [4], se ensayó el efecto del dominio efector de MARCKS en la exocitosis acrosomal estimulada con calcio o con un análogo de DAG, ambos inductores de la exocitosis acrosomal. Se observó, entonces, que el dominio efector de MARCKS inhibe la exocitosis acrosomal estimulada por ambos inductores. Para analizar el efecto de la fosforilación del dominio efector de MARCKS se prepararon proteínas mutantes recombinantes que imitan los estados fosforilados y no fosforilados del dominio efector y fueron ensayadas en espermatozoides permeabilizados. Los resultados obtenidos muestran que el dominio efector no inhibe la exocitosis acrosomal cuando está fosforilado. El objetivo de este trabajo fue, entonces, analizar la localización ultraestructural de la forma fosforilada de MARCKS por técnicas de crioultrainmunomarcado. Utilizando un anticuerpo específico que sólo reconoce el dominio efector cuando está fosforilado, se observó que fosfo-MARCKS localiza en el citosol de la cabeza del espermatozoide y probablemente por ello no afecte la fusión de membranas durante la exocitosis. Además también se localizó fosfo-MARCKS en la pieza media y en la cola del espermatozoide, sugiriendo su participación en la motilidad del espermatozoide. Estos resultados sugieren que MARCKS se encuentra presente en espermatozoides humanos, participa en la exocitosis acrosomal y que el estado de fosforilación de la proteína regularía su participación en este proceso exocítico. Referencias [1] Mayorga LS, Tomes CN, Belmonte SA. IUBMB Life. 2007; 59(4-5):286-92. [2] Breitbart H, Naor Z. Rev Reprod. 1999; 4(3):151-9. [3] Arbuzova A, Schmitz AA, Vergères G. Biochem J. 2002; 362(Pt 1):1-12. [4] Yunes R, Michaut M, Tomes C, Mayorga LS. Biol Reprod. 2000; 62(4):1084-9.