Adipogénesis de células madre obtenidas de tejido adiposo humano

GOJANOVICH, A. D.; UHART, M.; DEL VELIZ, S.; BUSTOS, D. M.; FRONTINI LÓPEZ, Y. R.

Mendoza

Jornada; Primeras Jornadas de Estudiantes de Ciencias Exactas y Naturales (JECEN); 2016

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UNCUYO

Las células madre mesenquimales adultas se encuentran en varios órganos y tejidos como adiposo, óseo, hígado, cerebro, placenta, cordón umbilical, sangre, y páncreas. Éstas son esenciales en el proceso de regeneración tisular. Son multipotentes, es decir capaces de diferenciarse a células de múltiples órganos y sistemas como osteoblastos, adipocitos, condrocitos, fibroblastos y neuronas, lo que genera un gran interés en su uso potencial en medicina regenerativa e ingeniería de tejidos. Las ASC (células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo) presentan numerosas ventajas frente a otras células, entre las que se cuentan la abundancia y disponibilidad en tejidos adultos, la facilidad de aislamiento y expansión en cultivo. Son células fenotípica y funcionalmente similares a las células madre mesenquimales derivadas de medula ósea, positivas para los antígenos de superficie CD29, CD73 y CD90, y negativas para CD31 y CD45 entre otros. In vitro, la diferenciación de las ASC a adipocitos se da por la adición de un conjunto de drogas (cocktail de diferenciación) entre las que se incluyen drogas sintéticas (dexametasona, IBMX, rosiglitazona) y hormonas peptídicas (insulina).En nuestro laboratorio obtenemos las células ASC humanas (hASC) a partir de tejido adiposo subcutáneo (sólido o lipo-aspirado) proveniente de cirugías estéticas de pacientes sanos que donan bajo consentimiento informado parte del tejido que se les extrae, que de otro modo se descartaría en la cirugía. Dicho consentimiento y el protocolo correspondiente fueron aprobados por el Comité de Bioética de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Cuyo (EXP-FCM 14594/2014). Las hASC se purifican a partir de 5 a 10 g de tejido adiposo siguiendo el protocolo de Zhu et. al. (Zhu et al., 2008) y se cultivan en medio DMEM (Gibco, Life Technologies, Denmark) suplementado con 10% Suero Fetal Bovino, 1% L-Glutamina y los antibióticos penicilina y estreptomicina. Las células amplificadas en cultivo son almacenadas en nitrógeno líquido, o utilizadas directamente para los experimentos. Las hASC son caracterizadas por inmunofenotipo determinado por citometría de flujo, para lo cual utilizamos el BD Stemflow? hMSC Analysis Kit, lo que nos permite una caracterización de las mismas por análisis multicolor de marcadores de superficie. Nuestra caracterización incluye los marcadores positivos CD90, CD105 y CD73 y los negativos CD34, CD11b, CD19, CD45 y HLA-DR (Bourin et al., 2013). Para la diferenciación adipogénica utilizamos el método de Zuk et al. modificado (Zuk et al., 2001). Las vacuolas lipídicas se evidenciaron por tinción con red oil O.Nuestros resultados incluyen la obtención de una población fenotípicamente homogénea de células madre mesenquimales adultas a partir de tejido adiposo subcutáneo (Fig. 1). La caracterización de marcadores de superficie por citometría de flujo mostró un alto porcentaje de células conteniendo los marcadores positivos CD-73 (96,4%) y CD90 (97,7%), mientras que el marcador CD105 (presente en algunas poblaciones de células madre, Bourin et al., 2013) sólo dio positivo en el 0,071% de nuestra población. El cocktail de marcadores negativos dio acorde a lo esperado sin señal en el 88,7% de nuestro aislamiento. Esta caracterización indicó que nuestra población está altamente enriquecida en células madre (Fig. 2). En la mezcla de drogas de inducción adipogénica que habitualmente usamos en el laboratorio probamos insulinas de diferente origen, bovina y humana. La primera es producida en el animal y purificada, mientras que la segunda es recombinante. La insulina bovina purificada dio igual o mejor grado de diferenciación que la humana recombinante, por lo que continuamos utilizando la primera en experimentos posteriores. Actualmente me encuentro ensayando el efecto de drogas biosimilares al GLP-1 (glucagon-like peptide 1) en la adipogénesis de hASC.Agradecemos al Prof. Dr. Orlando Lafalla por su invaluable ayuda presentándonos a la comunidad de cirujanos plásticos de la región de cuyo. ADG y YRFL son becarias doctorales de CONICET, DMB y MU son miembros de la carrera Investigador del CONICET. Financiación: ANPCyT (PICT´11-1450 y PICT´12-2498) y del CONICET (PIP 0304 y 2519).Bourin, P., Bunnell B.A., Casteilla, L., Dominici, M., Katz, A.J., March, K.L., Redl, H., Rubin, J.P., Yoshimura, K., Gimble, J.M. (2013). Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15(6):641-8.Zhu, Y., Liu, T., Song, K., Fan, X., Ma, X., y Cui, Z. (2008). Adipose-derived stem cell: A better stem cell than BMSC. Cell Biochemistry and Function 26, 664-675.Zuk, P.A., Zhu, M., Mizuno, H., Huang, J., Futrell, J.W., Katz, A.J., Benhaim, P., Lorenz, H.P., y Hedrick, M.H. (2001). Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Engineering 7, 211-228.