Estudio de la interacción entre componentes que participan en la cascada de transducción de señales durante la reacción acrosomal

BRANHAM MT; BUSTOS MA; RODRIGUEZ JF; RUETE MC; ZARELLI VEP; TOMES CN

Mendoza, Argentina (virtual)

Jornada; X Jornadas de Investigación FCM UNCuyo; 2008

Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Cuyo

Introducción y objetivos             En células exocíticas la fusión de membranas está gobernada por una maquinaria proteica responsable simultáneamente de evitar la secreción prematura y garantizar la liberación instantánea al arribar la señal de calcio. Algunos componentes de esta maquinaria son proteínas integrales de la vesícula (Rab3A, sinaptotagmina, R-SNAREs como sinaptobrevina) y de la membrana plasmática (Q-SNAREs como SNAP-25 y sintaxina), mientras que otros son solubles (NSF, Munc18, complexina).  El acrosoma es un gránulo secretorio que se libera por exocitosis regulada (reacción acrosomal, RA) cuando el espermatozoide encuentra al ovocito durante la fecundación y también in vitro en respuesta a estimulantes. La RA requiere calcio y todas las proteínas de fusión arriba mencionadas además de Epac, un blanco para el AMP cíclico (cAMP), Rap1 y fosfolipasas (PLC) (1;2).  Hemos encontrado que la RA procede a través de dos vías principales (Figura 1), una conducente al anclado del acrosoma a la membrana plasmática mediado por Rab3-α-SNAP/NSF-Munc18-SNAREs-complexina (3-6) y otra a la liberación del calcio acrosomal (7) mediada por Rap y PLC (Branham et al, en preparación).  Epac se ubica en una etapa temprana común a ambas.Objetivos 1) Desentrañar las cascadas de transducción de señales relacionadas al AMPc durante la exocitosis del acrosoma (Branham)2) Obtener Rab3A recombinante pura y funcional (Bustos)3) Establecer la/s etapa/s moduladas por Munc18 y las proteínas que interactúan con ella durante la exocitosis (Rodriguez)4) Determinar la regulación de la actividad de NSF en espermatozoides por fosforilación en tirosina y su correlato funcional en la RA (Zarelli, Ruete)Métodos             Por medio de Western blots e inmunofluorescencias indirectas determinamos la presencia y localización de proteínas en espermatozoides humanos. Su participación en la RA y su ubicación en la cascada de señalización se detectan por medio de un ensayo funcional desarrollado en nuestro laboratorio, donde la membrana plasmática de espermatozoides humanos se permeabiliza con estreptolisina-O (SLO) (8).  Este abordaje nos permite introducir en las células anticuerpos, proteínas recombinantes, toxinas, iones, quelantes, etc para luego evaluar su función en la RA.  El estado acrosomal se evalúa tiñendo con FITC-acoplado a PSA y contando al microscopio de fluorescencia.  Para estudiar el estado de activación de Rap y Rab3A se utilizan ensayos de pull down inmovilizando dominios proteicos con alta afinidad por dichas proteínas en estado GTP.  Las fluctuaciones en la concentración intracelular de calcio se realiza con sondas fluorescentes tanto en estudios poblacionales (leídos en espectroflorómetro) como en células individuales (video microscopía de fluorescencia de alta resolución). La expresión de proteínas recombinantes se lleva a cabo en Ecoli y la purificación se realiza por cromatografía de afinidad. El grado de pureza se evalúa por SDS-PAGE y tinción con Coomassie blue.Resultados Figura 1: Rap está presente en espermatozoides humanos y es requerida para la RA antes de la salida del calcio acrosomal.  Los inductores de la RA calcio y 8-pCPT-2´O-Me-cAMP (un análogo del cAMP selectivo para Epac) inducen la activación de Rap y también, indirectamente, la de Rab3A (Figura 2).  sAC es la adenilato ciclasa que sintetiza el cAMP relevante para la RA y su actividad es requerida para las vías iniciadas por calcio y por Rab3A recombinante, otro inductor de la RA.  La exocitosis también depende de una actividad de PLC que sintetiza el IP3 que se requiere para la movilización de calcio interno.Figura 2: En eucariontes, Rab3A sufre geranil-geranilación en su extremo carboxilo terminal.  Hemos logrado prenilar Rab3A recombinante inmovilizada sobre bolitas de agarosa, con lo que obtenemos preparaciones de mayor pureza que las disponibles anteriormente en el laboratorio (Figura 3A, comparar carriles1 y 2).  Rab3A prenilada y cargada con GTPγS dispara la RA, no así la no prenilada o la cargada con GDPβS (Figura 3B).Figura 3: Munc 18-1 se requiere para la RA en una etapa posterior al tethering dependiente de Rab3A y previa a la salida de calcio acrosomal, una etapa donde las SNARES se encuentran en configuración monomérica. Munc18-1 recombinante también bloquea la exocitosis (Figura 4B) durante la misma ventana de tiempo en lo hace el anticuerpo anti-Munc18-1.  El dominio citoplasmático de syntaxina 1 salvaje, pero no el de una mutante deficiente en la unión a Munc18, rescata el bloqueo de la proteína recombinante.Figura 4: PTP1B cumple un papel esencial en la RA  a posteriori de Rab3A y antes del eflujo de calcio del acrosoma (Zarelli et al, en revisión).  PTP1B indirectamente causa el desensamble de complejos cis SNARE al desfosforilar (y desreprimir la actividad de) NSF.  Este último, expresado en bacterias y fosforilado en tirosina, sirve como sustrato de PTP1B in vitro.Conclusiones Las vías de transducción de señales que gobiernan la exocitosis del acrosoma incluyen componentes mas (Munc18 y NSF) y menos (cAC, Epac, PTP1B) clásicos.  Asimismo, la actividad de NSF se desreprime por defosforilación en tirosina catalizada por PTP1B, en lo que  constituye el primer ejemplo de este fenómeno en secreción.  Es posible la geranilgeranilación de Rab3A in vitro en fase sólida, lo que permite obtener  de manera económica preparaciones de gran pureza.