Análisis de la reacción cortical de ovocitos de ratón en tiempo real

CAPPA AI; DE PAOLA MM; MICHAUT MA

Jornada; I Jornadas de Estudiantes de Ciencias Exactas y Naturales de la UNCuyo; 2016

La fecundación de un ovocito por un espermatozoide desencadena su activación para iniciar el desarrollo embrionario. Uno de los primeros signos de la activación ovocitaria es la exocitosis de los gránulos corticales, proceso conocido como reacción cortical, imprescindible para evitar la poliespermia. El objetivo de este trabajo fue estudiar la dinámica de la reacción cortical en tiempo real en ovocitos de ratón CF-1 activados partenogenéticamente y comparar la cinética entre ovocitos ovulados (madurados in vivo) y ovocitos madurados in vitro. Para observar la reacción cortical se utilizó la lectina Lens culinaris conjugada con FITC (LCA-FITC) para teñir el contenido de los gránulos corticales secretado al espacio perivitelino. Los ovocitos ovulados fueron obtenidos a partir de oviductos provenientes de hembras estimuladas hormonalmente con PMSG y hCG. Para la maduración in vitro, los ovocitos fueron colectados en medio MEM/milrinone a partir de ovarios de hembras estimuladas con PMSG y luego madurados in vitro en medio CZB (medio para madurar ovocitos de ratón) o GIVF (medio para madurar ovocitos humanos) durante 17hs, en presencia o ausencia de células del cúmulo. Sólo los ovocitos con corpúsculo polar fueron seleccionados en todos los grupos. Los ovocitos de cada condición fueron montados en una cámara conteniendo medio M2 libre de calcio y magnesio y activados partenogenéticamente con cloruro de estroncio 30 mM en presencia de la lectina LCA-FITC. Los ovocitos madurados in vivo e in vitro fueron estimulados el mismo día para obtener resultados comparables. Las imágenes fueron capturadas en un microscopio invertido acoplado con un sistema de iluminación LED y una cámara de alta resolución espacial y temporal. Se tomaron imágenes cada 1 min durante 1 h y, finalmente, las células fueron fijadas, permeabilizadas y teñidas con la lectina Lens culinaris conjugada con rodamina para cuantificar los gránulos corticales por microscopía confocal. Los resultados mostraron que el 86 % de los ovocitos ovulados reaccionó, en promedio, a los 17 min de haber recibido el estímulo. Por el contrario, de los ovocitos madurados in vitro, sólo un 12% reaccionó independientemente del medio de maduración utilizado y lo hizo en promedio a los 30 min de comenzado el estímulo. Nuestros resultados muestran la dinámica de la reacción cortical en tiempo real y revelan que, si bien la maduración in vitro no afecta las características morfológicas del ovocito, altera su competencia para exocitar los gránulos corticales.