IHEM   20887
INSTITUTO DE HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA DE MENDOZA DR. MARIO H. BURGOS
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
EFECTO DE PROTEÍNA RAB 11 EN EL TRANSPORTE INTRACELULAR DE BRUCELLA ABORTUS
Autor/es:
GONZÁLEZ J,; TELECHEA A,; DEGARBO S,; DAMIANI M,; MAYORGA L,; ARENAS G.
Lugar:
Mendoza - Argentina
Reunión:
Jornada; X Jornadas Virtuales de Investigación de la Fac. Ciencias Médicas - UNCuyo; 2008
Institución organizadora:
Fac. Ciencias Médicas - Univ. Nac. de Cuyo
Resumen:
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS La brucelosis es una zoonosis de alto impacto  en salud humana y animal en nuestra  provincia y país. Brucella es un parásito intracelular capaz de sobrevivir en fagocitos profesionales y no profesionales, cuyos mecanismos de sobrevida no han sido dilucidados. Las GTPasas Rab juegan roles importantes en la regulación del transporte intracelular. En la maduración del fagosoma se adicionan nuevas proteínas en la vía endocítica y otras se remueven por eventos de reciclado. Rab 11 incrementa la fagocitosis y regula el reciclado, por ello, nos propusimos estudiar el rol de la proteína Rab 11 en la maduración de fagosomas normales y fagosomas conteniendo estas bacterias. MATERIALES Y MÉTODOS En esta primera etapa del proyecto se utilizaron como modelo de células fagocíticas líneas celulares de macrófagos Raw y células epiteliales HeLa (las cuales están dando mejores resultados hasta el momento) y CHO. Las cepas de bacterias que se utilizarán serán de Brucella abortus 2308 (virulenta) y las cepas vacunales de virulencia atenuada S19 (cepa lisa) y RB51 (cepa rugosa). El cDNA de Rab11a fue amplificado y extraido del plásmido pGEX-2T. Por mutagénesis dirigida se obtuvieron las mutantes Rab:11Q70L (forma activa de Rab11 unida a GTP) y Rab11:S25N (mutante inactiva de Rab11 unida a GDP). Las secuencias de DNA mutantes fueron subclonadas en el vector pEGFP-C1 que codifica para la proteína fluorescente verde (Colombo M y Stahl P). Para la purificación del DNA se utilizó la técnica de Minipreps de Promega. Los plásmidos fueron titulados para todas las mutantes utilizadas. RESULTADOS              El cDNA de Rab11aWT y sus mutantes Rab:11Q70L (forma activa de Rab11) y Rab11:S25N (mutante inactiva de Rab11) fueron subclonados en el plásmido pEGFP-C1 como proteínas de fusión que expresan la proteína fluorescente verde en E. coli BL21. Los clones fueron seleccionados por su resistencia a la geneticina (Fig 1). Para la purificación del DNA se siguió el protocolo de la técnica Minipreps (Fig 2). Las células HeLa fueron transfectadas con 1 µg de DNA plasmídico utilizando LipofectAMINA 2000. Luego se generararon líneas celulares transientes que sobreexpresan GFP-Rab11aWT, Rab11aQ70L y Rab11aS25N.. En ensayos de fagocitosis se utilizaron  Brucella abortus 2308, S19 y RB51 marcadas con rhodamina. Las células transfectadas fagocitaron las bacterias marcadas durante 30 minutos y luego se mantuvieron 2h a 37ºC antes de fijar con paraformaldehído para detener el proceso endocítico en estadios tempranos. Los preparados se montaron con Moviol.La expresión de las proteínas transfectadas en las células y los ensayos de fagocitosis con las diferentes cepas de Brucella, fueron analizados por microscopía  confocal (Fig.3). CONCLUSIONES Nuestros resultados hasta el momento nos han permitido determinar que el modelo funciona para la transfección transiente de células HeLa, que si bien son fagocitos no profesionales obtuvimos mejores resultados que con otras células epiteliales. La infección con las diferentes cepas de Brucella fue altamente eficiente. Las cepas vacunales S19 y RB51, así como la cepa virulenta 2308 de Brucella reclutan a Rab11WT y a la mutante activa Rab11Q70L a la membrana del fagosoma que las contiene. Este reclutamiento es en forma de parches discretos. Los fagosomas con partículas inertes incorporan Rab11 a su membrana en estadíos tempranos, pero luego esta Rab es reciclada. La permanencia de Rab11 asociada a fagosomas de Brucella, sugiere que la bacteria retiene activamente esta Rab para evitar la maduración del fagosoma que la contiene.