PARTICIPACIÓN DE GTPASAS RAB EN LA BIOGÉNESIS Y MADURACIÓN DE FAGOSOMAS DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS PERSISTENTES

CAPMANY A,; PAVAROTTI M,; LEIVA N,; POCOGNONI C,; DAMIANI MT.

Mendoza - Argentina

Jornada; X Jornadas Virtuales de Investigación de la Fac. Ciencias Médicas - UNCuyo; 2008

Fac. Ciencias Médicas - Univ. Nac. de Cuyo

La fagocitosis constituye el principal mecanismo de defensa del hospedador ante la invasión de microorganismos patógenos. Las bacterias se internalizan en vesículas llamadas fagosomas, los que sufren una extensa remodelación hasta adquirir capacidad hidrolítica y microbicida. Esta “maduración” involucra un activo intercambio por fusión con compartimientos de la vía endocítica y vesículas derivadas del Golgi, y eventos de fisión que se relacionan con procesos de reciclaje desde el compartimiento fagosomal. Se han identificado más de 200 proteínas en la membrana de los fagosomas, entre las que se destacan GTPasas monoméricas de la familia Rab, elementos esenciales para el control del transporte de membranas y vesículas. Diferentes Rabs intervienen durante el proceso de maduración del fagosoma a lo largo de la vía fagocítica. Rab5 es necesaria para la biogénesis del fagosoma temprano, mientras que Rab7 se asocia a fagosomas maduros y regula la fusión fagosoma-lisosoma. Nuestro grupo ha demostrado que Rab11 además de regular la fagocitosis también participa en el reciclaje desde el compartimiento fagosomal. Recientemente se ha descripto a Rab14, una GTPasa localizada en la vía biosintética y endosomal temprana, que regula el tráfico de vesículas entre el complejo de Golgi y los endosomas. Rab14 está estrechamente relacionada con RabD de Dictyostelium, donde regula la fagocitosis, la fusión homotípica entre fagosomas y la formación del fagolisosoma. Recientemente se ha señalado que Rab14 es crítica en el mantenimiento del bloqueo de la maduración del fagosoma de Mycobacterium tuberculosis. Ciertos microorganismos interfieren con el proceso normal de fagocitosis, alterando el reclutamiento y/o liberación de ciertas proteínas Rabs de la membrana del fagosoma que los contiene, generando un nicho intracelular donde sobrevivir en las células hospedadoras. Los integrantes de la familia Chlamydiaea, como C. pneumoniae y C. trachomatis son parásitos intracelulares estrictos que residen y proliferan en un compartimiento poco acídico, no degradativo llamado inclusión. El ciclo de desarrollo de Chlamydia involucra una forma infectiva llamada “cuerpo elemental” (EB) que se diferencia en una forma metabólicamente activa llamada “cuerpo reticular” (RB). Luego de múltiples ciclos de replicación, el volumen de la inclusión aumenta hasta que la célula hospedadora se lisa y las formas infecciosas son liberadas. La vacuola que contiene Chlamydias está enriquecida en Rab4 y Rab11, GTPasas que regulan en el reciclaje de receptores. Nuestro objetivo es investigar si Rab14 participa en la biogénesis y desarrollo de la inclusión de Chlamydia. Para ello debimos generar un plásmido recombinante que codifique para la síntesis de Rab14wt fusionada a la proteína fluorescente verde (GFP) de modo de poder ser visualizada por microscopía de fluorescencia o confocal. Utilizamos también formas mutantes de Rab14: Rab14S25N (mutante constitutivamente unida a GDP) y Rab14DGCGC (mutante citosólica que carece del sitio de prenilación). Las bacterias utilizadas fueron Chlamydia trachomatis LGV, agente causal del linfogranuloma venéreo, y como hospedadoras células HeLa, una línea celular de carcinoma de cuello de útero humano. En la Fig. 1 se observa la distribución de la proteína Rab14 y sus mutantes en células HeLa después de 24hs de transfección. Se puede apreciar como Rab14wt (proteína salvaje) se asocia a pequeñas vesículas distribuidas en el citoplasma y se concentra en la zona perinuclear correspondiente al Golgi. La mutante unida a GDP (Rab14S25N) muestra un patrón más reticular y queda predominantemente retenida en el Aparato de Golgi. La mutante inactiva que no puede unir la cola de prenilos que le permite asociarse a los lípidos de las membranas (Rab14DGCGC) se mantiene citosólica. Las células que sobreexpresan Rab14 y sus mutantes fueron infectadas con Chlamydia trachomatis LGV durante 2,30 horas y luego se incubaron a 37ºC en estufa con 5%CO2 por diferentes períodos de tiempo para observar la biogénesis y desarrollo de la inclusión bacteriana. En la Fig. 2 se observan células a las 10hs posteriores a la infección. El DNA bacteriano se ha teñido con Hoescht, al igual que el núcleo celular. En las imágenes se puede observar claramente el reclutamiento de Rab14wt (verde) a la inclusión de Chlamydia (azul). Esta asociación es independiente del estado GTP ó GDP de la Rab, ya que se observa la presencia de la mutante Rab14 S25N unida a GDP en la membrana de la inclusión. No se observa reclutamiento de la proteína fluorescente verde (GFP) usada como control ni de la mutante citosólica de Rab14 (Rab14DGCGC) a la inclusión de Chlamydia. En la Fig. 3 se observan células que sobreexpresan Rab14 y sus mutantes a las 24 hs post-infección con Chlamydia trachomatis LGV. En estas imágenes se observa claramente que la mutante citosólica de Rab14 (Rab14DGCGC) disminuye el desarrollo y tamaño de la inclusión de Chlamydia. Esto indica que es necesaria la presencia de Rab14 en la membrana de la inclusión para que ésta pueda desarrollarse normalmente. La Fig. 4 muestra células transfectadas con Rab14 y sus mutantes infectadas por 48hs con C. trachomatis LGV. En las imágenes se puede observar que a tiempos tardíos de infección, Rab14 se internaliza hacia el interior de la inclusión en forma de vesículas discretas. La mutante citosólica inactiva de Rab14 (Rab14 DGCGC) además de enlentecer el desarrollo de la inclusión, disminuye la replicación bacteriana. Los resultados obtenidos indican que Chlamydia trachomatis LGV recluta activamente a Rab14 a la inclusión, y que este reclutamiento favorece el desarrollo de un nicho intracelular óptimo para el desarrollo de la bacteria. La presencia de ciertas proteínas o moléculas en la superficie de la membrana fagosomal es crítica para determinar el destino final del fagosoma. Las GTPasas Rab son esenciales para controlar el tráfico intracelular de vesículas, y por lo tanto, la fusión fagosoma-lisosoma. Es probable que las Chlamydias, alterando la dinámica de reclutamiento de estas proteínas Rab a la membrana de la inclusión, generen un nicho favorable para su replicación, evitando la maduración del fagosoma y la presentación de antígenos. El estudio de la maquinaria que regula el transporte a través de la vía fagocítica es crítico para entender la relación entre microorganismos parásitos y la célula hospedadora.