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La actividad de un gen determinado puede ser suprimida por ciertos RNA de doble hélice llamados RNA de interferencia (A. Fire and Craig C. Mello, Premio Nobel de Fisiología y Medicina 2006). En la mayoría de las células de mamíferos esto da lugar a una fuerte respuesta citotóxica que puede evitarse mediante la utilización de una molécula de RNA sintética de pequeño tamaño (21 a 22 nucléotidos de longitud) conocida como siRNA (short interfering RNA) (Elbashir et al., 2001). Este nuevo mecanismo para la regulación de la expresión génica puede ser utilizado para estudiar la función de diferentes proteínas en biología celular y del desarrollo. Proponemos el diseño y construcción de un vector de expresión en células eucariotas capaz de producir la síntesis intracelular de RNA de interferencia específico para la proteína Rab11a cuya función en la vía fagocítica describió nuestro laboratorio (Leiva et al, 2006). Esta nueva herramienta muy utilizada en la actualidad en biología celular, permitirá complementar estudios de sobreexpresión de la proteína y sus mutantes activas e inactivas, con los resultados obtenidos cuando se suprime la presencia de dicha proteína mediante el bloqueo de la expresión del gen que la codifica. En este trabajo se utilizaron técnicas convencionales de biología molecular y celular. El vector utilizado fue pSuper.GFP/neo al cual se le insertó el oligonucleótido que diseñamos específicamente para hRab11a. En la Fig. 1 Panel A se observa un esquema del proceso de generación del transcripto de RNA de interferencia a partir del vector plasmídico pSuper. Las condiciones a cumplir por el oligonucleótido diseñado a fin de lograr una buena eficiencia en el silenciamiento del gen de interés son: tener entre 17 y 23 pares de bases incluyendo una pequeña secuencia complementaria específica al mRNA de la proteína que se desea bloquear, incluir las secuencias sense y antisense separadas por 9 nucleótidos (hairpin) que a modo de bucle permite el apareamiento de dichas secuencias al transcribirse y procesarse el RNA dentro de la célula, y tener extremos compatibles a los generados en el vector por corte con las enzimas de restricción Bgl II y Hind III. El extremo 5 de la cadena corresponde al sitio de corte de Bgl II y el extremo 3 a Hind III. En la Fig. 1 Panel B se observa la secuencia de bases del oligonucleótido diseñado a partir del conocimiento de la secuencia del RNA mensajero para la proteína Rab11. Se utilizaron programas on line provistos por las mismas empresas que se dedican a la síntesis y comercialización de productos para iRNA y trabajos publicados previamente. Se encargó su síntesis a la empresa OligoEngine, USA. En la Fig. 1 Panel C se observa un esquema del vector pSuper.GFP/neo vacío, en el que se insertará el oligonucleótido diseñado. Este vector además de codificar para la síntesis del siRNA, codifica para la expresión de la proteína fluorescente verde (GFP), lo que permite distinguir la célula que lo expresa mediante microscopía de fluorescencia o confocal por su color verde.Utilizando técnicas de biología molecular, se prosiguió con la construcción del vector recombinante. Primero, las dos hebras del oligonucleótido se hibridaron en diferentes condiciones hasta obtener la forma óptima de generar la doble cadena a ser insertada en el vector pSuper. Es de notar, que la Tm (Melting temperature) de estos oligos es muy alta ya que las secuencias sense y antisense incluidas en cada hebra tienden a hibridarse, y deben aplicarse altas temperaturas para desestabilizar esa hibridación y permitir el apareamiento entre las dos hebras de oligonucleótidos. Se comprobó la generación correcta de la doble hebra por corridas en geles de poliacrilamida (Fig.2 Panel A). Se purificó el vector pSuper.GFP/neo, se lo cortó con las enzimas Bgl II y Hind III en forma secuencial y se lo extrajo desde el gel de agarosa (Fig. 2 Panel B). La ligación del vector cortado con el oligonucleótido hibridado se realizó con la enzima T4 ligasa durante toda la noche a 16ºC. La incorporación del inserto en el vector destruye el sitio para la enzima de restricción BglII, tornando insensible al plásmido recombinante ligado a la acción de esta enzima. Esto permite diferenciar el plásmido ligado del que no aceptó nunca el inserto (Fig. 2 Panel C). Luego del tratamiento con BglII, se transformaron bacterias E. coli cepa C55110 Dam negativas para evitar interferencia con las metilasas con el DNA plasmídico obtenido. Se aislaron las colonias con el plásmido recombinante debido a su resistencia a ampicilina (Fig. 2 Panel D). Se chequeó la correcta formación del plásmido recombinante, se purificó DNA plasmídico para utilizarlo posteriormente y se generó un stock de bacterias transformadas con el plásmido generado. Para verificar la capacidad del plásmido recombinante generado de bloquear in vivo la síntesis de la proteína Rab11a, se introdujo este vector en células HeLa utilizando lipofectamina como agente de transfección. En la Fig. 3 se observa en verde la expresión de la proteína fluorescente GFP, lo que indica que esa célula ha incorporado el plásmido pSuper.GFP vacío (control) en los paneles superiores o pSuper.GFP.hRab11a recombinante en los paneles inferiores. La proteína Rab11a endógena se visualiza por inmunofluorescencia indirecta con un anticuerpo específico y un secundario marcado con Cy-3 (rojo). La proteína Rab11a adopta una distribución puntiforme vesicular con mayor concentración en la zona perinuclear. En los paneles superiores, se puede visualizar que en las células que expresaron por 48hs el vector pSuper.GFP vacío (verde) la síntesis de hRab11a (rojo) no se ve alterada. Mientras que en los paneles inferiores, las células que expresaron por 48hs el vector recombinante generado pSuper.GFP.hRab11a (verde) poseen menor expresión de la proteína Rab11 endógena (rojo), evidenciado por la menor marca roja asociada a vesículas observable en el panel derecho. Esto nos permite afirmar que el vector plasmídico generado para la síntesis in vivo de siRNA es capaz de bloquear la expresión intracelular de la proteína Rab11 contra la cual fue diseñado. Esta herramienta será útil para estudiar la función de Rab11 y proteínas que interaccionen con ella en el transporte intracelular.