Sistemas in vitro e in situ para la evaluación del rol de la S-palmitoilación en la transducción de señales

GONZALEZ POLO, V.; RODI, P.; GENNARO, A.; PATTERSON, S.I.

Córdoba, Argentina

Workshop; From Light Perception to Vision. Seeking for Retinal Function and Evolution; 2007

Sociedad Argentina de Neurociencias (SAN)

En la transdución de señales se reconoce cada vez más la importancia de la formación de complejos de señalización asociados con regiones limitadas de la membrana celular. Estos complejos se forman por medio de múltiples tipos de interacción entre proteínas y entre estas y la membrana. Una modificación postraduccional que ha sido propuesta de tener un rol en la asociación de proteínas con la membrana es la S-palmitoilación, la ligación del ácido graso a cisteínas. Para evaluar el rol de esta modificación en la transducción de señales en neuronas, hemos desarrollado dos sistemas de investigación: (i) aislación de dominios membranales resistentes a la solubilización con detergentes de sinaptosomas de cerebro de la rata adulta; y (ii) la expresión de proteínas palmitoiladas in vitro y sus interacciones con membranas artificiales. Estos dos sistemas complementarios nos permiten evaluar por un lado los factores fisiológicos que produce la translocación de proteínas palmitoiladas a complejos asociados con la membrana sináptica de neuronas y por otro lado investigar y manipular las condiciones necesarias para esta translocación Sobreexpresamos la proteína GAP-43 en bacteria y mediante pasos secuenciales de precipitación selectiva y cromatografía de intercambio de iones (FLP- QXL) produjimos una proteína GAP-43 no palmitoilada de alta pureza. Se analizó en sistemas de membranas artificiales la asociación de GAP-43. Se armaron tres sistemas de liposomas de diferente composición pero con carga neta positiva, aportadas por fosfatidilserina (20%). Obtuvimos así liposomas diferentes temperaturas de transición y en tres estados fisicos: a la temperatura de trabajo (30∞C) liquido cristalino (lc), liquido ordenado (lo) y gel. Observamos una interacción positiva de la proteína con las membranas y mayor en el sistema en estado gel.  Debido a que esta GAP-43 es muy hidrofílica y carece aparentemente de algún dominio hidrofóbico de unión a membrana, la interacción de la proteína con la membrana se le atribuye priincipalmente a la palmitoilación de sus dos cisteínas (posición 3,4) del N-terminal. Sin embargo hay evidencias que GAP-43, aun sin estar palmitoilada, interacciona electrostáticamente a través un dominio acídico en una región N-terminal (33-53) con la membrana plasmática. Nuestros resultados confirman la interacción electrostática de la proteína no palmitoilada con las membranas con carga positiva.