Desarrollo de un modelo animal de infección genital por Chlamydia trachomatis para el estudio in vivo de la patogénesis

LUJÁN AGUSTÍN; FILI SILVINA; GAMBARTE JULIAN; DAMIANI MT

Otro; Jornadas Virtuales; 2014

Exposición sintética de la labor desarrollada durante el año de ejecución de la becaSe desarrolló un modelo de infección genital con Chlamydia trachomatis en ratones hembras y también se reprodujo en células en cultivo la infección clamidial. En estos modelos se probó la eficiencia como agente anticlamidial de un inhibidor de la kinasa Akt. Debido a que las Chlamydias son bacterias exclusivamente intracelulares, para la generación de stocks bacterianos se necesita realizar cultivos celulares homogéneos donde uno puede contabilizar las Unidades Formadoras de Inclusión (UFIs) y calcular la Multiplicidad de Infección (MOI) que será utilizado tanto en experimentos de cultivo celular (in Vitro) como en modelos animales (in Vivo). Para poder llevar a cabo estos experimentos se infectaron grandes cantidades de células HeLa con cepas tipificadas de C. trachomatis serotipo L2. A las 48h post infección (pi) se lisaron las células infectadas y se purificaron los cuerpos elementales (EBs - formas infectivas de la bacteria) por centrifugación diferencial. Luego se estimó la infectividad de los stocks contabilizando las UFIs y se congelaron las bacterias en nitrógeno líquido, momento en el cuál se encuentran listas para ser utilizadas en ensayos de infección y desarrollo de inclusiones tanto in Vitro como in Vivo.Se realizaron cultivos de células HeLa, se infectaron con C. trachomatis y se aplicó a estas un tratamiento con un inhibidor específico de Akt (iAkt), estimando su eficacia según como alteraba el crecimiento, la replicación y la infectividad de la cepa bacteriana.También, se desarrolló un modelo de infección en ratones C57, inoculando cepas de Chlamydia trachomatis humanas por vía vaginal, para acelerar nuestra comprensión de la patogénesis clamidial in vivo y para probar nuevas estrategias terapéuticas. La puesta a punto del modelo animal demandó la prueba de diversas variables en búsqueda del mejor escenario para reproducir la infección clamidial in vivo, tales como determinar la concentración de bacterias a utilizar (Unidades Formadoras de Inclusión), el momento del ciclo estrogénico en que se inocularon, la utilidad de la sensibilización previa (Progesterona) y la edad de los animales. Para corroborar la infección in vivo, se extrajeron los úteros de los ratones y se incluyeron en parafina para luego realizar cortes en microtomo. Sobre estos cortes, se realizaron tinciones histológicas y técnicas de inmunofluorescencia con anticuerpos específicos que identificaron la bacteria C.trachomatis dentro de las células de los úteros de ratón mediante microscopia confocal, validando el modelo de infección. Además se utilizó la técnica de PCR (Reacción de Cadena Polimerasa) para identificar de forma específica a C.trachomatis en el tejido obtenido del ratón, corroborando los resultados positivos obtenidos mediante la inmunofluorescencia. Luego de realizar la infección in Vivo, se aplicó un tratamiento homólogo al utilizado en los cultivos celulares para inhibir Akt, mediante el uso de Sirolimus (RapamuneR).El tratamiento farmacológico se aplico por vía vaginal a partir del día 28 pi, siendo aplicado 4 veces, día por medio, hasta el momento del sacrificio.Una vez finalizado el protocolo, respetando siempre las normas sobre el cuidado y uso de animales de laboratorio aprobados por el Comité de Cuidado de Animales (CICUAL), se procedió a la extracción de los úteros para realizar su estudio, determinando sus características anatómicas (peso, longitud, macroscopía), histológicas (tinciones de Gram y Gimenez) y la aplicación de los métodos de inmunofluorescencia específica para la detección específica de la bacteria. También se procedió a la extracción de ADN de dichos tejidos infectados para proceder a la amplificación del gen bacteriano que codifica para la principal proteína de la membrana externa clamidial (MOMP), un gen específico de serotipo L2 y un plásmido bacteriano por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).