Participación de galectinas en la infección Chlamydia trachomatis-célula hospedadora

ESPEJO G; SILVA R; DAMIANI MT; LEIVA N

Jornada; XIII Jornadas virtuales de investigación de la Facultad de Ciencias Médicas.; 2014

FCM- UNCuyo

La becaria Georgina Espejo y este trabajo recibió mención como mejor trabajo de estudiante. Introducción: Los microorganismos patógenos intracelulares han desarrollado diversas estrategias para sobrevivir y parasitar las células infectadas. Chlamydia trachomatis es la causa bacteriana más frecuente de enfermedades de transmisión sexual, tanto en los países desarrollados como en los menos desarrollados. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que cada año 89 millones de nuevos casos ocurren en el mundo, lo que convierte a la infección genital causada por Chlamydia en un serio problema de salud pública. Chlamydia trachomatis, al igual que las otras especies de Chlamydias patogénicas para el hombre, son bacterias Gram negativas intracelulares obligadas que residen y proliferan en una vesícula no acídica, llamada inclusión, evitando la degradación en el fagolisosoma. Estas bacterias son capaces de manipular la maquinaria molecular de la célula hospedadora y además interferir con la presentación de antígenos y la respuesta inmune. Al mismo tiempo, tergiversa el transporte vesicular para recibir nutrientes de la célula hospedadora, indispensables para su supervivencia y replicación. La patogenicidad de Chlamydia puede explicarse parcialmente por una respuesta inmune alterada. Estas bacterias han desarrollado diferentes mecanismos para evitar el reconocimiento y destrucción mediada por el sistema inmune innato y adaptativo. Las galectinas constituyen una familia de proteínas altamente conservada en la evolución con un dominio semejante de reconocimiento de carbohidratos, teniendo afinidad por beta-galactósidos (Galβ1-4-NAcGlc) y ausencia de péptido señal para su secreción. Tienen un rol activo en inmunidad, inflamación y cáncer. Son moléculas que participan en la interacción célula hospedadora-patógeno, el inicio de la respuesta inmune innata y adaptativa, y pueden promover la resolución o exacerbación de la inflamación asociada a la infección microbiana. La respuesta inmune alterada podría ser responsable del daño tisular ocasionado por Chlamydia, el establecimiento de inflamación e infecciones crónicas, su persistencia intracelular o su diseminación. Objetivos generales y específicos: Nuestra hipótesis supone que las galectinas estarían participando en el reconocimiento patógeno-célula hospedadora ayudando de esta manera a su internalización y favoreciendo el establecimiento de un nicho intracelular en las células infectadas. Por ello, el objetivo general de este trabajo es estudiar el rol de esta proteína durante la infección clamidial. Los objetivos específicos de este trabajo son analizar la localización subcelular de Galectina 1 en células infectadas por Chlamydia trachomatis y subclonar el cDNA de Galectina 1 que se encuentra en el plásmido pcDNA.C1 en el vector pEGFP.C1 para el estudio in vivo de la dinámica de la proteína. Resultados: En la Figura 1 se muestran las distintas familias de Galectinas. Se han descripto 15 subfamilias de galectinas en mamíferos, localizadas en un amplio espectro de tejidos y se las clasifican en tres tipos de acuerdo a sus características estructurales. Las Galectinas proto-type, son proteínas que se comportan como homodímeros (no unidos covalentemente) compuestos por dos Dominios de Reconocimiento de Carbohidratos (CDR) idénticos que reconocen estructuras simples de carbohidratos disacarídicos. Las Galectinas con secuencias repetitivas, poseen dos CDR estructuralmente distintos, que les confieren la propiedad de interaccionar con carbohidratos disímiles y las Galectinas chimera-type, desempeñan su función a través de una interacción dual, contactan con carbohidratos a través de su CDR situado en el dominio carboxi-terminal y con otros ligandos, como polipéptidos y polinucleótidos, a través de su dominio amino-terminal rico en prolina y glicina, el cual media las uniones células-células o células-matriz extracelular. La proteína Galectina 1, la cual pertenece a la familia de Galectinas proto-type, es la que vamos a utilizar para este proyecto. Como primer paso, quisimos ver la localización subcelular de la proteína endógena en células infectadas. En la Figura 2 se muestra una línea celular humana HeLa 229 (el linaje al cual pertenecen estas células derivan de una muestra de cáncer cérvico-uterino) infectadas con el patógeno intracelular Chlamydia trachomatis serovar L2. Las células infectadas fueron fijadas a distintos tiempos post-infección (0 hs, 10 hs, 20 hs y 48 hs p.i) y marcadas con un anticuerpo de conejo anti-Galectina 1 y a continuación con un anticuerpo anti conejo marcado con FITC. En las imágenes se puede observar una distribución vesicular de Galectina 1 endógena (mostrada en color verde) en todo el citoplasma celular y a medida que transcurre el tiempo de infección, la proteína Galectina 1 se localiza perinuclear y rodeando la membrana de la inclusión clamidial (como podemos apreciar en la magnificación). El ADN eucariota y procariota se marcó con Hoechst (color azul). Luego, para subclonar Galectina 1 en el vector pEGFP.C1, se transformaron bacterias E.coli cepa XL1b con el plásmido pcDNA.C1-Gal1, como se observa en la Figura 3. Cada colonia representa un clon de bacterias transformadas con dicho vector. Se eligieron dos colonias, que se crecieron en medio de cultivo LB en presencia del antibiótico ampicilina. El plásmido fue posteriormente purificado por mini-preps. La concentración de ADN plasmídico se cuantificó por espectrofotometría. En la Figura 4, se observa el corte con las enzimas de restricción BamHI y HindIII del plásmido pcDNA.C1-Gal1 y pEGFP.C1 durante dos horas a 37°C y corrido en un gel de agarosa al 1%. Podemos observar que los dos plásmidos fueron cortados por las enzimas de restricción, lo que permitirá su uso para la generación del nuevo vector recombinante pEGFP.C1-Gal1. Resumiendo, la proteína endógena Galectina 1 se encuentra rodeando la membrana de la inclusión clamidial en el transcurso de la infección con el patógeno Chlamydia trachomatis. Además, podremos estudiar la dinámica intracelular de esta proteína mediante la generación de una herramienta para sobreexpresar Galectina 1 marcada fluorescentemente. Se logró transformar bacterias con el plásmido pcDNA.C1-Gal1 y cortarlo en sitios específicos con enzimas de restricción, además cortamos el vector donde vamos a subclonar el gen de la Galectina 1. Estamos trabajando en la etapa final, la cual nos va a permitir obtener el plásmido recombinante donde el cDNA de Galectina 1 esté subclonado en el vector pEGFP.C1. Esta herramienta nos permitirá seguir el estudio in vivo de la proteína en células infectadas con el patógeno intracelular Chlamydia trachomatis.