Desarrollo de un modelo animal de infección genital por Chlamydia trachomatis para el estudio in vivo de la patogénesis

LUJAN A; FILI S; GAMBARTE J; DAMIANI MT

Jornada; XIII Jornadas virtuales de investigación de la Facultad de Ciencias Médicas.; 2014

FCM- UNCuyo

El becario Agustin Luján y este trabajo recibió mención como mejor trabajo de investigación básica en la categoría investigador joven. INTRODUCCIÓN Chlamydia trachomatis (CT) es el patógeno bacteriano transmitido sexualmente más común en el mundo. Produce una variedad de enfermedades clínicas, como tracoma, uretritis, cervicitis, epididimitis, embarazo ectópico, enfermedad inflamatoria pélvica, obstrucción de la trompa de Falopio e infertilidad. Las infecciones causadas por Chlamydia pueden tratarse con antibióticos, sin embargo debido a su naturaleza asintomática, la mayoría de los infectados no reciben tratamiento. En ocasiones, las infecciones inadecuadamente tratadas progresan y causan graves problemas de salud reproductiva, dejando secuelas irreversibles. OBJETIVOS Este proyecto propone el desarrollo de un modelo de infección genital en ratones, inoculando cepas de CT que infectan humanos por vía vaginal. La reproducción de la infección en un animal permitirá estudiar la patogénesis de la infección clamidial in vivo, validar los resultados obtenidos in vitro en células en cultivo y probar nuevas estrategias terapéuticas en búsqueda de reducir la evolución a la cronicidad. MATERIAL Y MÉTODOS Ratones. Diez ratones hembra, C-57 WT, de 4 semanas de edad, que se manipularon de conformidad con las directrices del Comité de Protección de los Animales (CICUAL) quien aprobó los protocolos utilizados. C. trachomatis. Se utilizó CT serovar L2 provistas por la Dra. Patricia Galarza, Jefe del laboratorio de enfermedades de transmisión sexual de ANLIS (Hospital Malbrán). Esta cepa se propagó en células HeLa cultivadas en D-MEM. Luego los cuerpos elementales (forma infectiva) se purificaron por centrifugación en gradientes de densidad y se almacenaron a -80°C, siendo descongeladas inmediatamente antes de su uso. La multiplicidad de infección (MOI) de CT se determinó mediante el método de las Unidades Formadoras de Inclusión (IFUs) las que fueron cuantificadas por microscopía de fluorescencia. Infección de los ratones. Los animales se sensibilizaron con progesterona previo a la inoculación de bacterias para sincronizar el ciclo estral murino. Se administró una dosis única de 2,5 mg de acetato de medroxiprogesterona (Holliday) por vía subcutánea 7 días previos a la infección con la cepa de CT- L2. Los animales fueron divididos en 3 grupos, como se muestra en la Figura 1: el primer grupo (A) se inoculó por vía vaginal con 1,2 x 107 unidades formadoras de inclusión (UFIs) de CT en 0,03 mL de tampón fosfato salino (PBS), el segundo grupo (B) se inoculó por vía vaginal con 1,5 x 105 UFIs de CT en un mismo volumen de PBS, y el tercer grupo (Control) recibió una dosis intravaginal de 0,03 mL de PBS sin bacterias. Las inoculaciones se realizaron bajo anestesia con Ketamina (Holliday) - Xilazina (Kensol-Konig) utilizando una aguja de calibre 28 unida a jeringa de tuberculina de 1 mm3 (BD ?). Figura 1. Hisopado vaginal. El flujo vaginal se recogió con micro-aplicadores desechables (Multi-Brush ? - Denbur, Inc.) en los días 7, 14 y 28 post-infección (PI). Para la observación mediante microscopía óptica se colorearon con técnica de Giemsa prolongado. También se analizó la presencia de CT con por inmunofluorescencia directa con anticuerpos (Ac) específicos anti MOMP (major outer membrane protein) (verde). Se evidenció la presencia de actina o tubulina por inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos específicos (rojo), y el ADN eucariota y procariota por tinción con Hoechst (azul). Anatomía. El tracto reproductivo de los ratones infectados y controles se disecó al final del experimento (28 días PI) para determinar sus características anatómicas (peso, longitud, macroscopía) y se incluyeron en parafina para cortar en micrótomo y proceder a su observación microscópica. Detección de C. trachomatis. Para la detección de CT en los úteros disecados, se realizaron varios cortes de las piezas previamente incluidas en parafina. Después de los tratamientos de desparafinación, las secciones de tejido fueron sometidas al protocolo de Inmunofluorescencia directa (IFI), aplicándoles un Ac específico para CT acoplado a fluoresceína (Verde) junto con yoduro de propidio (IP) para marcar el ADN eucariota y procarioa (Rojo). Las muestras se observaron con un Microscopio Confocal Olympus FluoView ? FV1000 equipado con múltiples filtros (Olympus, Melville, NY). RESULTADOS Se observaron las características anatómicas de los úteros disecados. Los ratones infectados con CT presentan alteraciones morfológicas. En particular, la longitud del útero se reduce en forma significativa (*, p