Generación de un modelo de trabajo para el estudio de Neisseria gonorrhoeae

PAEZ F; DAMIANI MT; QUINTERO C

Jornada; XIII Jornadas de Investigación de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Cuyo; 2014

FCM- UNCuyo

Introducción Neisseria gonorrhoeae es una bacteria de transmisión sexual que afecta exclusivamente a humanos. En particular, coloniza las mucosas de la uretra, endocervix, tubo de Falopio, recto y conjuntiva faríngea. Las infecciones causadas en el aparato genital varían desde infecciones agudas de resolución favorable hasta enfermedad inflamatoria pélvica (PID) que cronifica provocando secuelas irreversibles como obstrucción tubárica y esterilidad. Puede causar embarazos ectópicos, abortos en el primer trimestre del embarazo y esterilidad. El mayor riesgo para el recién nacido son las infecciones oculares que pueden derivar en ceguera. Esta bacteria Gram negativa presenta una alta tasa de mutaciones puntuales y la capacidad de modular su superficie antigénica en forma rápida y constante, lo que le permite colonizar las células huésped y evitar el sistema inmune. Además, el gonococo puede invadir distintos tipos de células humanas o comportarse como un patógeno extracelular. La gonorrea afecta cada año a 60.000.000 de personas, con mayor incidencia en países menos desarrollados. Es la segunda enfermedad bacteriana de transmisión sexual más frecuente en el mundo después de las causadas por Chlamydia trachomatis, con un agravante: su alta capacidad de desarrollar resistencia a los antibióticos. En los últimos años, se han reportado cepas de N. gonorrhoeae con resistencia a diferentes generaciones de antibióticos, que incluyen tetraciclinas, macrólidos, sulfonamidas y trimetoprima, en tratamientos combinados, y más recientemente a quinolonas. Nuevos estudios confirman además una disminución de la susceptibilidad de los gonococos a cefalosporinas de amplio espectro. Objetivo General El objetivo general de este proyecto es conocer en detalle la relación que establece N. gonorrhoeae con la célula hospedadora, en la búsqueda de nuevas herramientas que permitan contener el avance de la enfermedad. El conocimiento de la maquinaria molecular involucrada en la infectividad, replicación y/o persistencia intracelular de Neisseria gonorrhoeae contribuirá al desarrollo de nuevas terapias efectivas para su erradicación. Objetivos específicos - Generar un modelo de trabajo para el estudio de la infección causada por Neisseria gonorrhoeae - Analizar el papel de proteínas reguladoras del transporte intracelular, como Rab39a y Rab39b en la infección por N. gonorrhoeae. Estos objetivos pretenden contribuir al conocimiento de las estrategias utilizadas por esta bacteria para modificar en forma selectiva el tráfico vesicular, en particular de la vía fagocítica, es lo que le permite generar un compartimento intracelular permisivo donde sobrevivir y reproducirse. Materiales Células epiteliales HeLa: línea celular derivada de un carcinoma de cérvix humano Bacterias: Neisseria gonorrhoeae cepa ATCC® 49226? (cedida por la Dra. Patricia Galarza Jefa del Servicio de Enfermedades de Transmisión Sexual, INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán) y Neisseria gonorrhoeae no piliada, cepa MS11 Wt, cepa Opa- (N302), cepa Opa50 (N303), cepa Opa52 (N309) y cepa Opa57 (N313) (cedidas por el Dr. T. F. Meyer, Department of Molecular Biology, Max Planck Institute, Berlin, Germany) y E. coli (para amplificación de plásmidos) DNA: plásmidos para sobreexpresar Rab39a y Rab39b acoplados a la proteína fluorescente verde (GFP), plásmidos para sobreexpresar receptores CEACAM, equipo de purificación de DNA plasmídico, syber safe para visualización de DNA Reactivos: anticuerpos específicos contra determinadas organelas y proteínas eucariotas, reactivo de transfección (fosfato de calcio), buffer Hepes, buffer Tris-EDTA (TE), cloruro de calcio, buffer fosfatos (PBS), paraformaldehído, saponina, cloruro de amonio, Mowiol, agarosa para electroforesis horizontal. Material de cultivo celular: medio DMEM, suero fetal bovino, antibióticos (gentamicina, penicilina, ampicilina), placas de cultivo, cubreobjetos, portaobjetos Material de cultivo de bacterias: LB sólido, LB agar, antibióticos (ampicilina, vancomicina, colistina, nistatina y trimetoprima), medio Thayer-Martin, agar base GC suplementado con hemoglobina (BRITALEX), placas de petri Equipamiento: microscopio confocal, equipo de electroforesis, lector de placas UV Resultados En nuestro trabajo utilizamos células epiteliales HeLa, en las que en primer lugar analizamos la localización sub-celular de las dos isoformas de Rab39. Para ello, las células se transfectaron con construcciones de GFP-Rab39a o GFP-Rab39b. La transfección se realizó por métodos químicos (Ca3(PO4)2), como se describe a continuación: Lás células se sembraron en un multi-well de 24 pocillos, con un cubre-objeto cada uno. Una vez que llegaron al 70% de confluencia, fueron transfectadas. La solución de transfección se preparó utilizando 1µg de DNA + 22,5µl de TE (buffer) + 2,5µl de CaCl2 0,5M, y se incubó 5 minutosa temperatura ambiente. Luego se agregó 25µl de HEPES 2X (gota a gota, en vórtex) y se incubó en agitación 20 minutos a temperatura ambiente. Se agregó la mezcla a las células y a las 4 horas se cambió el medio, agregando un medio nuevo (DMEM+Suero Fetal Bovino). Luego, las células se incubaron 16 hs a 37ºC en atmósfera de 5%CO2. Posteriormente, las células fueron lavadas 3 veces en PBS, fijadas en para-formaldehido 3% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se permeabilizaron 20 minutos en Saponina 1%, y se incubaron con anticuerpos rabbit anti Lamp1 (1:3000) o mouse anti GM130 (1:800) durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente se incubó con anti rabbit o mouse acoplado a Alexa 546 durante una hora. Se montaron los cubre-objetos en porta-objetos con Mowiol. Las células se observaron en microscopio confocal (Figura 1) Rab39a localiza en endosomas tardíos y lisosomas. Rab39b localiza en el complejo de Golgi Las células HeLa no son invadidas naturalmente por N. gonorrhoeae al no expresar los receptores necesarios para la invasión, los que pertenecen a la familia CEACAM (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule). Por lo que el siguiente paso, fue obtener plásmidos purificados que codifiquen distintos receptores CEACAM (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule), los que fueron gentilmente cedidos por el Dr. S. Gray-Owen (Department of Molecular Genetics, University of Toronto, Toronto, Canada). En primera instancia E. coli fueron transformadas con el DNA plasmídico cedido por el Dr. Gray-Owen. Posteriormente, se sembraron las bacterias transformadas en placas de Petri con LB-Agar. Se seleccionaron las transformantes por presión selectiva con Ampicilina. Una colonia fue repicada en 3mL de LB-ampicilina líquido. Luego, se procedió a la obtención de los plásmidos purificados mediante un kit comercial ?Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System?. El DNA fue analizado por electroforesis en gel de agarosa. Las muestras se visualizaron al UV con SYBER-SAFE (Figura 2). Respecto a la bacteria, se cuenta con una cepa comercial (ATCC® 49226?) cedida por la Dra. Patricia Galarza (Servicio de Enfermedades de Transmisión Sexual, INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán) y cinco cepas utilizadas para el estudio de la relación huésped-patógeno: Neisseria gonorrhoeae no piliada, cepa MS11 Wt, Opa- (N302), Opa50 (N303), Opa52 (N309) y Opa57 (N313) generosamente cedidas por el Dr. T. F. Meyer (Department of Molecular Biology, Max Planck Institute, Berlin, Germany). Se preparó un medio selectivo de Thayer-Martin (TM) para el aislamiento de las distintas cepas de Neisserias, a partir de agar base GC con el agregado de hemoglobina, un suplemento de enriquecimiento que se usa para el aislamiento de bacterias nutricionalmente exigentes (BRITALEX) y una mezcla antimicrobiana VCNT (Vancomicina, Colistina, Nistatina y Trimetoprima). Se realizó el cultivo en placas de Petri, repicando las bacterias en el medio TM (Figura 3) a 37ºC con atmósfera de 5%CO2. Se mantuvo el cultivo por sucesivos repiques, ya que la bacteria es incapaz de sobrevivir en cultivo por más de 48hs. Los resultados preliminares nos han permitido optimizar las condiciones de cultivo de la bacteria, y las condiciones de transfección de células eucariotas para sobreexpresar Rab39. Conclusiones Se han generado los instrumentos necesarios para el establecimiento de un modelo de trabajo para el estudio de la interacción Neisseria gonorrhoeae-célula eucariota.