Triple colocalizacion y su validación estadística

BUONFIGLI, J; DAMIANI MT

Mendoza

Congreso; Tercer congreso Argentino de microscopía; 2014

SAMIC

El análisis de colocalización de moléculas usando imágenes de fluorescencia es una de las herramientas más comunes para determinar si ciertas moléculas ocupan la misma región celular y si pueden potencialmente interactuar [2-7]. Existen numerosas aplicaciones que calculan doble colocalización usando las diversas herramientas matemáticas que existen para dicho fin, y muchos de estos programas también evalúan la significancia estadística del resultado de colocalización obtenido comparando dicho resultado con imágenes generadas al azar [3, 5-7]. A pesar de la gran cantidad de aplicaciones disponibles, pocas de ellas calculan triple colocalización (información que no puede ser inferida a partir de las dobles [7]) y las que lo hacen fallan en la validación estadística de los resultados cometiendo error tipo 1. Es decir, consideran colocalización significativa a superposiciones debidas al azar. La razón por la que dichas aplicaciones cometen error tipo 1, al calcular la significancia estadística de la triple colocalización, radica en el criterio de aleatorización de imágenes (scrambling). En las aplicaciones disponibles los tres canales son aleatorizados para calcular la triple colocalización esperada por azar (Fig. 1b). El inconveniente de este criterio se fundamenta en el hecho de que rompe relaciones dobles que deben ser tenidas en cuenta (en el caso de que existan). Al aleatorizar los tres canales, el porcentaje de colocalización obtenido en las imágenes generadas será menor que el porcentaje de colocalización real (Fig. 1 a y b). Dado que es mucho menos probable que tres pixels se encuentren completamente por azar, a que un pixel encuentre por azar con dos pixeles superpuestos provenientes de canales que se sabe que colocalizan significativamente (Fig. 1b). De esta forma se interpretará erróneamente como significativa la triple colocalización cuando en realidad existe una fuerte relación positiva entre dos canales y un tercer canal cuyos pixels se localizan al azar respecto de los otros dos.TCSS (Triple Colocalization and Statistical Significance) es una aplicación para ImageJ que calcula doble y triple colocalización para coeficientes de Pearson, Manders [1, 2] y de intersección [8], y la significancia estadística para los coeficientes de Manders y de intersección. Además utiliza un algoritmo especial para el cálculo de la significancia estadística de la triple colocalización que selecciona el canal que menos colocaliza con los otros dos y solo aleatoriza dicho canal (Fig. 1c). De esta manera TCSS solo lleva al terreno del azar las relaciones triples y pondera las relaciones dobles que puedan existir entre los tres canales, evitando cometer error tipo 1 al calcular la significancia estadística. Por otro lado gracias al algoritmo que evita cometer error tipo 1, se evita en ciertas circunstancias específicas cometer error tipo 2, es decir, considerar como no significativos resultados que sí lo son. Además de este nuevo criterio de aleatorización, TCSS cuenta con otras herramientas para ajustar el cálculo de la significancia estadística y al mismo tiempo mejorar la reproducibilidad de los resultados. Una de ellas consiste en la generación automática de una segunda máscara que se circunscribe solo a la región que ocupan los fluoróforos y una vecindad cercana medida en pixels. Esta herramienta evita cometer error tipo 1 al confinar la región de scrambling solo al espacio donde verdaderamente se encuentran los fluoróforos. De esta manera se minimiza la parcialidad de generar manualmente la máscara, haciendo más reproducibles y representativos los resultados. Referencias: 1- E. M. M. Manders et. al. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. J Cell Sci. 1992 Nov;103 ( Pt 3):857-62. 2- E. M. M. Manders et. al. Measurements of co-localization of objects in dual-color confocal images. 1993. 3- Sylvain V. Costes et. al. Automatic and Quantitative Measurement of Protein-Protein Colocalization in Live Cells. Biophys J. 2004 Jun;86(6):3993-4003. 4- F. Jaskolski et. al. An automated method to quantify and visualize colocalized fluorescent signals. J Neurosci Methods. 2005 Jul 15;146(1):42-9. 5- S. Bolte et. al. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. 2006 6- O. Ramirez et. al. Confined Displacement Algorithm Determines True and Random Colocalization. J Microsc. 2006 Dec;224(Pt 3):213-32. 7- Patrik A. Fletcher et. al. Multi-Image Colocalization and its Statistical Significance. Biophys J. 2010 Sep 22;99(6):1996-2005. 8- Scientific Volume Imaging. http://www.svi.nl/ColocalizationCoefficients.