Rol del complejo motor Dineína/Dinactina de la célula hospedadora en la biogénesis de la Vacuola Parasitófora donde reside y se multiplica Coxiella burnetii

ORTIZ FLORES, RM; DISTEL, JS; COLOMBO, MI ; AGUILERA, MO; BERÓN, W

Mendoza

Jornada; Jornadas Virtuales de Investigación de la Facultad de Ciencias Médicas; 2014

Facultad de Ciencias Médica, U. N. de Cuyo

El complejo motor Dineina/Dinactina juega un papel importante en el tráfico de membrana en las células de mamífero. Se trata de un motor molecular con múltiples subunidades que impulsa el transporte de los distintos cargos desde las diferentes membranas a lo largo de los microtúbulos (Mts). La unidad Dinactina del complejo motor consta de subunidades distintas como p150glued y p50/dinamitina. Las pequeñas GTPasas de la familia Rab, presentes en los cargos provenientes de las membranas, interactúan con estas proteínas motoras para trasportar dicho cargo hacia la región perinuclear de la célula. Rab7, a través de la proteína adaptadora RILP (de sus siglas en inglés, Rab-interacting lysosomal protein), asocia el complejo motor Dineina/Dinactina a Rab7 y por ende, a los compartimientos endosomales transportado. Coxiella burnetii (Cb) es un patógeno intracelular obligado, causal agente de la fiebre Q, que transita a través de la vía fagocítica de célula huésped para formar una compartimiento con características autophagolysosomal llamado vacuola (PV). Rab7 es reclutado por esta PV y regula su formación, hecho anteriormente demostrado en nuestro laboratorio. Existe poca evidencia acerca de la interrelación entre el tráfico intracelular de Cb con el sistema motor de los Mts. Para determinar el papel de Mts/Dineina/Dinactina y Rab7/RILP en la biogénesis PV, células HeLa fueron transfectadas con los diferentes constructos pEGFP-p150glued WT, pEGFP-p50/Dinamitina WT, pEGFP-RILP WT, pEGFP-Rab7 WT y/o sus mutantes negativos (pRFP-p150glued-CC1, pRFP-RILPΔN, pRFP-RILP C33, pEGFP-Rab7T22N); y luego se llevó a cabo la infección con Cb. Después de 48h de infección, las células se procesaron para inmunofluorescencia indirecta y se analizaron por microscopía confocal. Los siguientes parámetros fueron determinados: número de células infectadas, la multiplicación intracelular de Cb (ensayo de Unidad Formadora de Foco o FFU), número y tamaño de las VP, y el reclutamiento de las proteínas estudiadas que decoran la PV. Los datos fueron ordenados y analizados en GraphPad Prism: los datos fueron comparados con Test de ANOVA, Postest de Dunnet, considerando diferencia significativa cuando p ≤ 0,001. Los resultados fueron expresados en promedio ± SEM. Los resultados mostraron que las formas WT de las subunidades del complejo motor Dineina/Dinactina sobreexpresadas fueron reclutados en la membrana de la PV asi como sus mutantes (Fig. 1). Las proteínas WT no afectaron significativamente su tamaño y número en comparación con el control (transfección de las células con el plásmido vacío expresando solo EGFP). Así el tamaño de las VPs se redujo y el número total de VPs aumenta cuando se sobreexpresan las proteínas mutadas. La multiplicación intracelular de Cb fue disminuida en células que sobreexpresan las proteínas mutadas con respecto a aquellos que sobreexpresan las proteínas WT (ensayo de FFU, FFU/ml). En cuanto a la sobreexpresión de la proteína adaptadora RILP, la proteína WT no afectó significativamente el tamaño y número de la VP, lo cual si ocurre con la sobreexpresión de las proteínas mutantes de RILP. Una vez más la multiplicación intracelular de Cb fue disminuida en células que sobreexpresan las proteínas mutadas (Fig. 2). Para demostrar el rol de cada una de estas proteínas, tanto subunidades del complejo motor Dineina/Dinactina como de la proteína adaptadora, RILP, se procede a co-sobreexpresar distintas combinaciones de las proteínas anteriormente mencionadas. Al sobreexpresar una proteína mutante en conjunto con una WT, se observó como el tamaño de las VPs se redujo y el número total de VPs aumenta, acentuando los resultados anteriores (Fig. 3). En conclusión, nuestros resultados sugieren que el transporte de los fagosomas que contienen C. burnetii, utilizarían el sistema Dineina/Dinactina, en conjunto con los Microtúbulos para ser transportados desde la periferia de la célula a la región perinuclear promoviendo la formación de PV.