Estudio microbiológico en heces de ratones lactantes inoculados intragastricamente con esporos de Clostridium botulinum a dos niveles de dosis infectiva.

FIGUEROA, E.; TRONCOSO, M.; PAREJA, V.; FERNANDEZ, R.; SOSA, M.; CABALLERO, P.

Mendoza

Jornada; Jornadas Virtuales de la FCMédicas de la UNCuyo 0ctubre 1014; 2014

Facultad de Ciencias Médicas - UNCuyo

El botulismo es una enfermedad neuroparalítica de alta letalidad, causado por las neurotoxinas botulínicas (NTBo) producidas por Clostridium botulinum (Cb) tipos A al G y menos frecuentemente por otros Clostridios, cuyo reservorio natural es principalmente el suelo (Su). Dentro de las formas fisiopatogénicas, el botulismo del lactante (BL) es actualmente la forma epidemiológica más frecuente del botulismo humano, causado por la colonización intestinal de las esporas de CPNB y posterior toxinogénesis sin situ, que afecta a niños menores de un año produciendo hipotonía, parálisis fláccida simétrica descendente y muerte por paro respiratorio. En Argentina, el primer caso se describió en 1982 y hasta diciembre de 2013 se han registrado 769 casos, ubicándose en segundo lugar en frecuencia luego de EE.UU. En el mecanismo de transmisión del BL intervienen el Su (reservorio natural y fuente de esporas) y como posibles vehículos: el polvo ambiental, miel y hierbas medicinales por la detección de esporas en los dos últimos. En estudios anteriores nosotros observamos diferencias tanto culturales como en las características de la NTBo de cepas provenientes de Su y las de BL, presumiendo que las cepas de Su podrían ser modificadas durante el su tránsito gastrointestinal. En este trabajo se estudiaron las características microbiológicas de la materia fecal (MF) de ratones lactantes (RL) posteriores a su paso por el intestino, luego de la inoculación (IG) con esporos de una capa de Su de Mendoza. Se selección la cepa de Su Mz 1935y se reactivó por siembra en caldo Tarozzi. Se control de pureza por siembra en agar en aerobiosis y anaerobiosis; y toxigenicidad por inoculación IP en ratón. Se produjeron esporos en medio producción de esporos y se estableció su recuento en medio especial para este fin. Se eligió dos niveles de dosis infectiva (DI50), 100 y 1000 esporos administrados IG en 0,01 ml de solución fisiológica (SF) estéril. Se usaron tres lotes de 10 RL de 8 días de edad en presencia de su madre debido a lactancia. Un lote se utilizó como control negativoy los otros dos para los dos niveles de DI50. Se recolectaron las MF a las 24, 48, 78 y 96 h (Imagen 1). Estas fueron tratadas del siguiente modo: A) Siembra en medio Tarozzi carne picada para control de toxigenicidad incubados 35ºC durante 4 días. B) Siembra en aerobiosis en medios selectivos y diferenciales para detección de bacterias coliformes totales, lácticas y Pseudomonas incubadas a 35ºC durante 24 h. C) Luego de heat shok 80ºC 10 min se sembró en agar al 4% , 4 días a 35ºC en anaerobiosis para aislamiento de Cb y su cuantificación. Se resuspendió 0,05g MF en 1,5 ml de SF estéril y se procesó del siguente modo: A) Inoculación IP en ratón adulto para evaluar tiempo de muerte con síntomas típicos de botulismo. B) Siembra en medio RVB, agar Rogosa y CLDE para evaluar presencia de bacterias nombradas en B. C) La MF de RL se diluyó 1:4, 1:8 1:16 y 1:32 para recuento posterior de Cb. Resultados La toxigenicidad de los caldos sembrados con MF de ratón lactante resulto mayor en diluciones 1:16 y 1:32 para ambas DI50 (Tabla1). Durante la prueba ninguno de los ratones lactantes durante el tiempo de trabajo mostró signos típicos de la enfermedad ni muerte. No se detectó crecimiento de coliformes, bacterias lácticas ni de Pseudomonas en los medios selectivos y diferenciales empleados en aerobiosis. En agar al 4% en anaerobiosis se detectó crecimiento de bacterias lácticas y colonias típicas de Cb, centro oscuro borde vidrio machacado fino semejante en morfología a las inoculadas provenientes del Su (Imagen 2 y 3). Los recuentos de colonias para Cb dieron: dia 1 y 2 incontables para todas las diluciones, día 3 para DI50 de 1000 esporos 5,4 103 UFC/ 0,05 g de MF y DI50 de 100 esporos 1,9 103 UFC/ 0,05 g de MF, representando una relación 1:4. Día 4 para DI50 de 1000 esporos 1,5 103 UFC/ 0,05 g de MF y DI50 de 100 esporos 0,3 103 UFC/ 0,05 g de MF, representando una relación aproximada 1:4 semejante a la anterior. Concluimos La toxicidad de los caldos de las MF fue mayor a diluciones mayores. La morfología cultural de las colonias no se vio modificada, para ninguno de los tiempos post administración IG por lo que debería ampliarse el tiempo post recolección para observar posibilidad de cambios. La microbiota aislada fue predominantemente anaeróbica tanto para bacterias lácticas como para bacilos Gram positivos esporulados tipo botulínicos, compatibles con la edad del RL . La eliminación de esporos se verificó hasta el 4to día, en una relación semejante de 1:4 para ambas DI. Deberá ampliarse estudios que se relacionen estos datos con las características de las toxinas producidas por los Cb aislados de la MF post tránsito intestinal.