Rol del complejo motor Dineína/Dinactina de la célula hospedadora en la biogénesis de la Vacuola Parasitófora donde reside y se multiplica Coxiella burnetii

ORTIZ FLORES R.M; DISTEL J.S; COLOMBO M; AGUILERA M.O; BERÓN W

Mendoza

Jornada; Jornadas de Investigación Facultad de Ciencias Médicas UNCuyo; 2014

Facultad de Ciencias Médicas UNCuyo

El complejo motor Dineina/Dinactina juega un papel importante en el tráfico vesicular en células de mamífero. Se trata de un motor molecular con múltiples subunidades que impulsa el transporte de los distintos compartimientos membranosos a lo largo de los microtúbulos (Mts). La unidad Dinactina del complejo motor está formado por las subunidades p150glued y p50/dinamitina. Las pequeñas GTPasas de la familia Rab, presentes en los compartimientos endosomales, interactúan con las proteínas motoras para transportarlos hacia la región perinuclear de la célula. Rab7, a través de la proteína adaptadora RILP ("Rab-interacting lysosomal protein"), se asocia el complejo motor Dineina/Dinactina a Rab7 para regular el transporte endosomal. Coxiella burnetii (Cb) es un patógeno intracelular obligado, agente causal de la fiebre Q, que transita a través de la vía fagocítica de célula hospedadora para formar una compartimiento con características autophagolysosomal llamado vacuola parasitófora (PV). Hemos demostrado que Rab7 es reclutado por esta PV y regula su formación. Existe poca evidencia acerca de la interrelación entre el tráfico intracelular de Cb y el sistema motor de los Mts. Para determinar el papel de Mts/Dineina/Dinactina y Rab7/RILP en la biogénesis PV, células HeLa fueron transfectadas con los diferentes constructos pEGFP-p150glued WT, pEGFP-p50/Dinamitina WT, pEGFP-RILP WT, pEGFP-Rab7 WT y/o sus respectivas mutantes negativos (pRFP-p150glued-CC1, pRFP-RILPΔN, pRFP-RILP C33, pEGFP-Rab7T22N); y luego infectadas con Cb. Después de 48h de infección, las células se procesaron para inmunofluorescencia indirecta y se analizaron por microscopía confocal. Los siguientes parámetros fueron determinados: número de células infectadas, la multiplicación intracelular de Cb (ensayo de Unidad Formadora de Foco o FFU), número y tamaño de las VP, y el reclutamiento de las proteínas estudiadas a la membrana de la PV. Los datos fueron ordenados y analizados en GraphPad Prism. Los datos fueron analizados con el Test de ANOVA, Postest de Dunnet, considerando diferencia significativa para p ≤ 0,001. Los resultados fueron expresados como la media ± SEM. Los resultados mostraron que las formas WT de las subunidades del complejo motor Dineina/Dinactina sobreexpresadas ​​fueron reclutados en la membrana de la PV asi como sus mutantes (Fig. 1, A). Las proteínas WT no afectaron significativamente el tamaño y número de VP en comparación con el control (células sobreexpresando solo EGFP), no obstante, el tamaño de las VPs se redujo y el número total de VPs aumentó cuando se sobreexpresaron las proteínas mutadas (Fig. 1 B y C). La multiplicación intracelular de Cb fue disminuida en células que sobreexpresaban las proteínas mutadas con respecto a aquellos que sobreexpresaban las proteínas WT (ensayo de FFU, FFU/ml) (Fig. 1 D). En cuanto a la sobreexpresión de la proteína adaptadora RILP, que también mostró reclutamiento a la VP (Fig. 2, A), la proteína WT no afectó significativamente el tamaño y número de la VP, lo cual si ocurre con la sobreexpresión de las proteínas mutantes de RILP (Fig. 2, B y C). Una vez más la multiplicación intracelular de Cb fue disminuida en células que sobreexpresan las proteínas mutadas (Fig. 2, D). Para demostrar el rol de estas proteínas, tanto subunidades del complejo motor Dineina/Dinactina como de la proteína adaptadora, RILP, se procedió a co-sobreexpresar distintas combinaciones de las proteínas anteriormente mencionadas (Fig. 3, A). Al sobreexpresar una proteína mutante en conjunto con otra WT distinta, se observó como el tamaño de las VPs se redujo y el número de VPs aumentó, acentuando los resultados anteriores (Fig. 3, B y C). En conclusión, nuestros resultados sugieren que el transporte de los fagosomas que contienen C. burnetii, utilizarían el sistema Dineina/Dinactina, en conjunto con los Microtúbulos para ser transportados desde la periferia de la célula a la región perinuclear promoviendo la fusión homotípica y heterotípica de los fagosomas, y, finalmente, la formación de PV.