Sondas de ADN que reconocen el gen rRNA 16S bacteriano hibridan con los corpúsculos pigmentados del Caracol Reina Lobatus gigas (Linnaeus 1758), implicancias filogenéticas y evolutivas

FEDERICO A. DELL AGNOLA; ISRAEL A. VEGA; ALFREDO CASTRO-VAZQUEZ

Jornada; XIII Jornadas de investigación de la facultad de Ciencias Médicas (UNCuyo); 2014

Facultad de Cs. Médicas - UNCuyo

INTRODUCCIÓN Grandes ?inclusiones marrones? intracelulares, ubicados dentro de la glándula digestiva en miembros de familias de moluscos cenogasterópodos marinos (Struthiolariidae, Strombidae) han sido descritas. Sin embargo, en la especie más ampliamente estudiada, el ?Caracol Reina? Lobatus gigas (Caenogastropoda, Strombidae) estos enigmáticos corpúsculos pigmentados han sido mencionados como parásitos eucariotas del filo Apicomplexa, un grupo de organismos patógenos, parásitos obligados intracelulares, con un complejo ciclo de vida, aunque los supuestos organismos no fueron reconocidos por las sondas específicas para el gen ribosomal eucariota rRNA 18S, ni pudo describirse la ultraestructura celular. La presencia del supuesto patógeno en todos los individuos muestreados, y la similaridad morfológica con los corpúsculos ?C? y ?K?, interpretados como formas de un mismo organismo procariota, en caracoles ampuláridos estudiados en nuestro laboratorio, sumado a la puesta a punto de técnicas tintoriales y moleculares, nos llevaron a conducir un estudio descriptivo, morfológico y molecular en los endosimbiontes de Lobatus gigas, y establecer diferencias y semejanzas con los descritos oportunamente en ampuláridos. Las consideraciones filogenéticas y evolutivas de estos hallazgos son discutidas en este trabajo. OBJETIVOS La posibilidad concreta de obtención de muestras de esta especie huésped, nos hicieron plantearnos los siguientes objetivos: (1) Comparar morfométricamente los corpúsculos aislados de Lobatus gigas, (2) determinar algunos caracteres de la pared celular y de la glándula del huésped por sus afinidades tintoriales y, (3) comprobar si las sondas EUB 338 y CYA 361, específicas de Eubacteria y Cyanobacteria, hibridan en los corpúsculos pigmentados de esta especie. MATERIALES Y METODOS Animales: tres ejemplares del Caracol Reina Lobatus gigas fueron colectados en una ensenada del Mar Caribe (Puerto Aventuras, estado de Quintana Roó, Península de Yucatán, Mexico; 20°30?32.32?? N, 87°12?35.49?? W). Estudios morfológicos glandulares: Porciones de glándula digestiva fueron fijadas en paraformaldehído, deshidratadas e incluidas en Histoplast®, cortadas y luego teñidas con azul Alcian-Nuclear Fast Red®-eosina, tinción histológica que diferencia las formas simbióticas de las células del huésped. Morfometría corpuscular: Desde sedimentos de glándula digestiva fijada, los corpúsculos ?C? y ?K?, liberados a la luz acinar, fueron medidos con el software ImageJ 1.47V (Wayne Rasband National Institutes of Health, USA). Hibridación in situ fluorescente: Desde cortes de 5 µm, los tejidos fueron expuestos a sondas de ADN (BSF 338 y CYA 361) asociadas a digoxigenina, que reconocen zonas específicas del gel rRNA, y posteriormente expuestas a un anticuerpo antidigoxigenina asociado a fluoresceína, para ser fotografiado finalmente en un microscopio de fluorescencia en el canal verde. RESULTADOS Los endosimbiontes de Lobatus gigas: Sedimentos de muestras de glándula digestiva, fijadas en paraformaldehído, muestran endosimbiontes similares a los descritos en ampuláridos. En L. gigas, no se ha reportado previamente la presencia de corpúsculos pigmentados amarillo verdosos, semejantes al endosimbionte ?C? encontrado en los ampuláridos; sin embargo, estos existen y son comparativamente más pequeños (8,84 µm ± 1,5, media ± DE; N = 202). Los corpúsculos ?K? de L. gigas son multilamelares, de forma ovalada y de color amarronado con un diámetro mayor de 33.29 µm ± 4,99, media ± DE; N = 208; y con un diámetro menor de 24,96 ± 3,3, N = 208. Estos corpúsculos son sin embargo notablemente más voluminosos que los descritos en Pomacea canaliculata, el ampulárido mas estudiado. En la glándula digestiva, pueden observarse conspicuos corpúsculos ?K?, pero dos subpoblaciones de corpúsculos ?C?, una muy afín al azul Alcian, lo que denota la naturaleza mucopolisacárida de su pared celular, y otra que no fija dicho colorante. Sin embargo, existe una transición entre ambas formas endosimbióticas. Por otra parte, pueden observarse numerosos núcleos celulares rosados, respetando la descripción morfológica de la glándula digestiva de los estrómbidos, y numerosos corpúsculos liberados a la luz acinar, en forma similar a lo descrito oportunamente en los ampuláridos sudamericanos. Por otro lado, ambas sondas, BSF 338 y CYA 361, específicas para regiones del gen ribosomal rRNA 16S bacteriano y cianobacteriano, son positivas sobre los endosimbiontes en el tejido fijado.Sin embargo, a diferencia de lo estudiado en ampuláridos, es notable la mayor afinidad de la sonda sobre los corpúsculos ?K?. CONCLUSIONES Dos grandes conclusiones pueden extraerse de este trabajo. Primero, si bien la glándula digestiva del hospedador Lobatus gigas presenta algunas diferencias notables, tanto en tipos celulares como en morfología, es notable el parecido entre los endosimbiontes de la especie con aquéllos observados en la familia Ampullariidae. Sin embargo, diferencias morfométricas fueron documentadas, por lo que parecería ser un simbionte especie-específico. Esto es sugestivo, ya que Strombidae es una familia derivada dentro de Caenogastropoda, respecto a la posición basal de Ampullariidae. Aparentemente, el consortium entre este enigmático organismo y el huésped molusco estaría mucho más ampliamente distribuído dentro de los cenogasterópodos que lo pensado hasta el momento. Segundo, la hibridación in situ muestra fehacientemente la naturaleza procariótica del endosimbionte y permite por tanto refutar la hipótesis de que los corpúsculos ?K? son formas de un parásito eucariota del phylum Apicomplexa.