USO DE UNA PROTEÍNA PERMEABLE RECOMBINANTE PARA EVALUAR EL ROL DEL AMPc EN LA EXOCITOSIS ACROSOMAL DE ESPERMATOZOIDES HUMANOS

LUCCHESI, ORNELLA; BUSTOS, MATÍAS; RUETE, MARÍA C; TOMES, CLAUDIA

Mendoza

Congreso; 3er Congreso Argentino de Microscopía; 2014

Sociedad Argentina de Microscopía

La reacción acrosomal (RA) es un evento clave para la fertilización del ovocito. Antecedentes previos de nuestro grupo indican que en respuesta a estímulos que disparan la RA, se produce un ingreso masivo de calcio desde el medio extracelular que activa la adenilato ciclasa soluble (ACs) y produce un incremento de AMPc citosólico. Esto lleva a la activación de la proteína Epac. A partir de este punto la vía se bifurca en dos ramas: una que activa Rap1 y que lleva a la salida de calcio desde un reservorio interno y la otra, que involucra la activación de Rab3A y que culmina con el ensamblaje de las proteínas SNAREs posibilitando el anclaje del acrosoma a la membrana plasmática. También se observan cambios morfológicos que afectan principalmente al acrosoma y que implican el hinchamiento del acrosoma, la ondulación de la membrana acrosomal externa y la aposición con la membrana plasmática. En forma conjunta, tanto el ensamblaje de las SNAREs, el eflujo de calcio acrosomal y el hinchamiento del acrosoma, convergen para desencadenar los pasos finales que conducen a la fusión de la membrana acrosomal externa con la plasmática. Sabemos de manera indirecta que el incremento en los niveles de AMPc citosólico está relacionado con los eventos que conducen a la RA; sin embargo, no ha sido comprobado de forma directa el efecto del AMPc en la regulación de estos procesos. Para ello, desarrollamos una herramienta que nos permitió depletar el AMPc intracelular y estudiar el rol de este mensajero en las vías señalización involucradas en la exocitosis del gránulo. Construimos una proteína permeable conformada por el dominio C-terminal de la subunidad RIβ de la PKA humana unida al péptido TAT que le confiere permeabilidad a membranas. Esta proteína -denominada esponja de AMPc- tiene dos sitios de unión para AMPc de alta afinidad. En primer lugar, medimos su efecto sobre la RA, comprobando que la proteína inhibió la exocitosis acrosomal inducida por progesterona y A23187 en células sin permeabilizar y la exocitosis disparada por calcio en células permeabilizadas. Posteriormente, evaluamos en cuál de las ramas es necesario el incremento de los niveles de AMPc. Para ello medimos el estado de activación de las proteínas Rap1 y Rab3A en células preincubadas con la esponja de AMPc y estimuladas con progesterona. Comprobamos que tanto la activación de la proteína Rap1 como Rab3A requiere un incremento en los niveles de este segundo mensajero. Luego analizamos si la salida de calcio del acrosoma es dependiente de los niveles de AMPc. Medimos la movilización de calcio acrosomal mediante ensayos en tiempo real en microscopio confocal, en los cuales las células permeabilizadas y cargadas con la sonda fueron incubadas con la esponja de AMPc y posteriormente estimuladas con calcio. La presencia de la esponja de AMPc inhibió la salida de calcio acrosomal, confirmando de forma directa que la vía de señalización que conduce a la liberación de calcio acrosomal depende de AMPc. Finalmente, evaluamos si el AMPc es necesario para el hinchamiento del acrosoma. Incubamos células sin permeabilizar con la esponja de AMPc y estimulamos la RA con progesterona y A23187. Evaluamos por microscopía electrónica de transmisión el porcentaje de células con acrosomas hinchados. Observamos que la depleción de AMPc inhibió el hinchamiento del acrosoma respecto a las células control. Los resultados obtenidos demuestran que el AMPc es una molécula fundamental que controla los eventos que conducen a la RA tales como: la activación de proteínas cruciales en ambas vías de señalización, la salida de calcio acrosomal y el hinchamiento del acrosoma.