La mutante fosfomimética de NSF (NSF Y83E) inhibe la reacción acrosomal

RUETE MC; LUCCHESI O; BUSTOS MA; QUEVEDO F; TOMES CN

Mendoza

Jornada; XXIII Jornadas de Investigación y V de Posgrado; 2013

Universidad Nacional de Cuyo

La reacción acrosomal (RA) es una secreción regulada esencial para la fertilización en mamíferos. Un miembro de la maquinaria de fusión, NSF, se encuentra inactivo por fosforilación en tirosina en espermatozoides en reposo. En consecuencia, los SNARE se encuentran ensamblados en complejos "cis", en lugar de ciclar entre este estado y la configuración monomérica. El disparo de la RA se activa a PTP1B, responsable de defosforilar a NSF y así desreprimir su actividad. NSF se une a las proteínas SNARE por medio de α-SNAP. Queremos establecer el mecanismo por el cual la mutante fosfomimética NSF-Y83E inhibe la RA. Mostramos que NSF-Y83E bloquea la RA disparada por calcio en espermatozoides humanos permeabilizados. Por ensayos funcionales e inmunofluorescencia indirecta encontramos que NSF-Y83E no desensambla los complejos SNARE como si lo hace la proteína salvaje. Además, desarrollamos un ensayo de "binding in vitro" y mostramos que no está disminuida la afinidad de la mutante por α-SNAP; y que además, NSF-Y83E disoció a α-SNAP de sintaxina. Determinamos por ensayos funcionales que el efecto inhibitorio ejercido por NSF-Y83E era revertido por PTP1B recombinante. Sugerimos que NSF-Y83E inhibe la RA porque secuestra a la PTP1B endógena, impidiendo que ésta defosforile al NSF endógeno. Estos datos permiten apoyar la idea de que la actividad de NSF no es constitutiva en todos los sistemas. Brinda una explicación para aclarar el mecanismo sobre como NSF-Y83E inhibe la secreción.