HEMINA INDUCE LA MADURACIÓN ERITROIDE ESTIMULANDO LA VÍA AUTOFÁGICA

FADER CM; VERGARA A; MOOR F; SALASSA N; COLOMBO MI

Mendoza

Congreso; XII Jornadas de investigación FCM-UNCuyo; 2012

La leucemia se define como la proliferación neoplásica de células hematopoyéticas con posterior proliferación, expansión y pérdida de maduración. Las leucemias representan una causa importante de mortalidad y morbilidad en la población argentina, en especial las leucemias linfoblásticas de desarrollo rápido. Según  la Organización Mundial de la Salud (OMS), a nivel mundial se registran más de 10 millones de nuevos casos de cáncer y más de 6 millones de defunciones por esta enfermedad, en el cual la leucemia es el tipo de cáncer más frecuente en la infancia. El diagnóstico y el tratamiento temprano de este tipo de neoplasia se ha convertido en el punto central de las iniciativas de salud mundial, ya que el impacto social y económico para un individuo y su familia, es realmente dramático debido a lo extenso de su tratamiento y al costo del mismo, siendo incluso muy difícil de afrontar por los sistemas de salud pública. La autofagia, en general, es considerada como un mecanismo por el cual macromoléculas citosólicas e incluso organelas enteras, son secuestradas en estructuras membranosas (autofagosomas), las cuales finalmente son transportadas a los lisosomas para su degradación. Una de las proteínas requeridas en la autofagia es la LC3, una proteína citosólica que es un buen marcador de autofagosomas, por lo cual es utilizada en nuestros ensayos para seguir la vía autofágica. Varios trabajos han demostrado la importancia de la autofagia en la maduración de algunos tipos celulares, como los reticulocitos, donde son secuestradas y degradadas organelas como mitocondrias para evitar la liberación de citocromo C que podrían llevar a la apoptosis a estas células. Nuestro modelo serán las células k562, una línea celular derivada de pacientes con leucemia mieloide crónica, por lo que tienen características eritroides. Esta línea celular es una buena herramienta como modelo de maduración y diferenciación, ya que dependiendo de la droga inductora pueden madurar a células de la línea megacariocítica o eritropoyética. El tratamiento de las células K562 por un regulador natural como la hemina (uno de los inductores de la eritropoyesis), el cual es trasportado por la hemopexina, da como resultado una acumulación de hemoglobina. A fin de estimular la maduración de las células K562, con su consiguiente producción de hemoglobina (Hb), las mismas fueron incubadas en medio de cultivo en presencia de distintos inductores de la maduración: 50 μM de hemina, 10 nM de PMA (ester de forbol), 100 μM de hidroxiurea o 1,4 mM de ácido butírico a 37ºC, durante 5 días. Posteriormente las células fueron recolectadas y analizadas. La concentración de Hb producida por la célula se midió analizando la actividad peroxidasa que presenta la Hb, la cual reduce el peróxido de hidrógeno y simultáneamente oxida la benzidina, dando una reacción colorimétrica. Esta reacción se realizó sobre un lisado celular, para luego cuantificar por espectrofotometría a 450nm el sobrenadante y directamente sobre un cultivo celular con posterior visualización de la marcación por microscopía óptica. Este resultado nos sugiere que hemina es un potente inductor de la maduración ya que,  su estimulación fue la más marcada (un aumento del 320%), comparado con el control (células K562 sin estimulación).   Posteriormente, quisimos estudiar qué efecto tenía este compuesto sobre la vía autofágica. Por lo tanto, incubamos células K562 que sobreexpresaban la proteína LC3 acoplada a GFP (proteína fluorescente verde) en presencia de los inductores mencionados anteriormente, y observamos que hemina producía un agrandamiento de las vesículas marcadas con LC3. Se cuantificó el porcentaje de células que generaron vesículas LC3 agrandadas frente a los diferentes inductores. Así mismo, quisimos  determinar los posibles cambios moleculares que puede sufrir la  proteína LC3 (marcador de estimulación de la vía autofágica) en presencia de un estímulo de maduración. Para ello se realizó un Western blot de un lisado de células K562, incubadas en presencia o ausencia de hemina, luego fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa e incubadas con un anticuerpo anti-LC3 y anti-tubulina. Como resultado, observamos que en aquellas células que fueron incubadas en presencia de hemina hubo un aumento de los niveles de LC3 total, así como un aumento de la relación de LC3II/tubulina, indicando una estimulación del flujo autofágico. Es sabido que la muerte mitocondrial lleva a la despolarización de dicha organela. Con la sonda TMRE podemos marcar y observar mediante microscopía confocal las mitocondrias que se encuentran polarizadas (intactas o vivas). En contraste, cuando la mitocondria se encuentra despolarizada dichas organelas no se marcan. Las mitocondrias presentes en aquellas células que se incubaron con hemina presentaban una marca más débil que aquellas incubadas en condiciones control. Esto sugiere que hemina produciría despolarización de algunas mitocondrias, lo cual es una señal intracelular para activar la mitofagia (degradación de las mitocondrias por autofagia). Para determinar si las mitocondrias estaban siendo degradadas en  vesículas autofágicas, decidimos utilizar células K562 sobreexpresando GFP-LC3 y las estimulamos durante 5 días con hemina. Posteriormente, las células se incubaron en presencia de  LysoTracker para marcar los compartimientos acidicos, o con un marcador de compartimentos degradativos (DQ-BSA), la cual es una proteína que se encuentra saturada de fluoróforo (esta saturación es tan grande que está autobloqueada su fluorescencia) y solo fluoresce cuando es cortada y degradada. De forma interesante las vesículas autofágicas se encontraban marcadas por ambos marcadores lisosomales, lo que sugiere que en células K562 incubadas en presencia de hemina, las mitocondrias serían atrapadas y degradadas en compartimentos autofagicos degradativos (autolisosomas). Por otro lado, quisimos determinar si los autolisosomas poseían mitocondrias en su interior, ya que la eliminación y degradación de las mitocondrias es uno de los marcadores de maduración eritroide. Para esto, se utilizaron células estables para GFP-LC3 estimuladas durante 5 días con hemina y marcamos en rojo las mitocondrias con mitotracker. Se observó por microscopía  de fluorescencia confocal que la estimulación con hemina aumento el número de mitocondrias adentro de autofagosomas. Lo que lleva a suponer que la hemina induce un aumento de la degradación mitocondrial, que se realiza por la vía autofágica. En conclusión, la manipulación de los posibles mecanismos que estimulen la maduración celular es un aspecto muy importante de la Oncología, los cuales en los últimos años están siendo intensamente estudiados mediante el uso de nuevas herramientas de Biología Celular y Molecular. Nuestros resultados sugieren que la inducción de los mecanismos de maduración podría activar la respuesta autofágica en células K562, respuesta que llevaría a una maduración más rápida y eficiente.