Identificación de una putativa célula madre en la hemolinfa de Pomacea canaliculata

ISRAEL VEGA, VALESKA SIMON Y PAULETTE CONGET

Congreso; VIII Congreso Latinoamericano de Malaclología; 2011

Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco

El proceso de la hemopoyesis en invertebrados ha sido largamente desconocido, sin embargo, las funciones esenciales de los hemocitos en procesos tales como la fagocitosis, la encapsulación o lisis de células extrañas son bien conocidas. Aquí presentamos nuestro esfuerzo por caracterizar las células madre de un molusco de agua dulce a través del estudio de la morfología, ciclo celular (ioduro de propidio, PI) y quiescencia celular (naranja de acridina, AO), tasa metabólica (actividad mitocondrial con el colorante JC-1), presencia de transportadores que excluyen moléculas tóxicas (Hoescht 33342) y el potencial de proliferación (CFSE: carboxifluorescein diacetate, succimidyl ester) de los hemocitos circulantes. El estudio morfológico mostró ambos tipos de hemocitos previamente descriptos (agranulocitos y granulocitos fundamentalmente eosinófilos). Adicionalmente, células pequeñas con escaso citoplasma fueron ocasionalmente observadas. La mayoría de los hemocitos se encuentra en estadio G0-G1 (~95%), siendo el porcentaje restante células ciclando entre la fase S y el estadio G2-M. En G0, encontramos un porcentaje variable de células (rango: 0 - 8,8%, N=3) con bajo contenido de RNA (AO sin RNAase) y baja actividad mitocondrial (rango= 0,5% - 4%; N=4), la cual fue inhibida en presencia de CCCP (carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone). La presencia constitutiva de transportadores que excluyen drogas tóxicas (MDR) ha sido propuesta para las células madre. En nuestros ensayos, la exposición a Hoechst 33342 permitió identificar un porcentaje pequeño de hemocitos expresando MDR (rango: 0,06% -0,12%; N=6). Este hallazgo fue confirmado en presencia de Verapamil 50 µM, un inhibidor del transportador. Finalmente, ~ 0,5 x 106 hemocitos por ml marcados con CFSE se mantuvieron 4 días en una placa de cultivo con medio Pomacea, en presencia o no de 5 fluoruracilo (FU). Nosotros observamos una desplazamiento hacia la izquierda de la marca poblacional de CFSE indicando proliferación celular; el porcentaje de células ciclando fue de 33% y 14%, para los grupos control y tratado con FU, respectivamente. En su conjunto, estos hallazgos permiten consolidar la idea de que la diferenciación de los hemocitos podría ocurrir a través de células quiescentes circulantes (con bajo contenido de RNA y actividad mitocondrial) que presentan transportadores MDR y conservan su potencial de proliferación in vitro.