PRODUCCIÓN Y ESPECIFICIDAD DE α-RAMNOSIL-β-GLUCOSIDASA

ORTIZ DA; MAZZAFERRO L; BRECCIA JD

La Plata

Simposio; SAPROBIO (Simposio Argentino de Bioprocesos); 2012

Las aplicaciones tecnológicas de las glicosil hidrolasas (EC 3.2.1.-) van desdela industria del papel, alimenticia y la producción de biocombustibles hasta la industria química fina. Recientemente describimos en nuestro laboratorio una nueva actividad enzimática: 9-ramnosil-:-glucosidasa (EC 3.2.1.168) producida por Acremonium sp. DSM24697. Esta es una ectoenzima, que se libera en forma soluble al medio extracelular durante la conidiogénesis. Dada la especificidad de sustrato de esta enzima hacia flavonoides 7-O-rutinosilados, y su modo de acción que permite desglicosilar dichos flavonoides en un solo paso, la misma presenta características promisorias para aplicaciones industriales. Los estudios de producción enzimática a partir del cultivo del microorganismo son relevantes para una aplicación inmediata debido al desconocimiento de su secuencia aminoacídica y, por lo tanto, carencia de su forma recombinante. El principal inductor descripto de la enzima 9- ramnosil-:-glucosidasa en la cepa DSM24697 es el flavonoide rhamnoglucosiladohesperidina (Fig. 1). En este trabajo se utilizaron subproductos de la industria citrícola de bajocosto para optimizar la producción de la actividad 9-ramnosil-:-glucosidasa. El extractoenzimático obtenido se comparó con glicosidasas comerciales. Resultados. Se utilizaron como fuente de carbono subproductos de la industria citrícola (pellets de naranja o limón) que contienen hesperidina en su composición. El cultivo sumergido de Acremonium sp. produjo actividad 9-ramnosil-:-glucosidasa, que se detectó en el sobrenadante de cultivo luego de 5-7 días. Se observó el máximo de producción con las formulaciones hesperidina-pellets en proporción 1:4 (15.9 y 8.5 U/l para naranja y limón, respectivamente). Los cultivos que contenían pellets presentaron una mayor cantidad de conidios, la cual está relacionada con la liberación de la enzima al medio extracelular. El análisis zimográfico del sobrenadante con mayor actividad mostró la presencia de una única banda de actividad con los sustratos MU-rutinósido y hesperidina, correspondiente a la 9-ramnosil-:-glucosidasa. Por otro lado, los cócteles enzimáticos comerciales hidrolizaron xilano, CMC y todos los sustratos fluorogénicos ensayados, pero no hesperidina. Además, la hidrólisis de MU-rutinósido por los cócteles no se debía a la presencia de una banda diferencial con la actividad 9-ramnosil-:-glucosidasa, sino a la inespecificidad de las proteínas mayoritarias. Conclusiones. Se logró un medio de cultivo para la obtención de 9-ramnosil-:-glucosidasa de bajo costo utilizando subproductos agropecuarios. El mismo hidrolizó específicamente hesperidina, y sería de utilidad para numerosas aplicaciones tecnológicas que involucren degradación y síntesis de moléculas rutinosiladas.