INVESTIGADORES
DOCENA Guillermo Horacio
congresos y reuniones científicas
Título:
Actividad inmunomoduladora de péptidos de Amaranthus hypochondriacus
Autor/es:
MORONTA JULIAN; DOCENA GUILLERMO; AÑON MARIA CRISTINA
Lugar:
Cordoba
Reunión:
Congreso; IV Congreso Internacional Ciencia y Tecnología de los alimentos; 2012
Resumen:
Los objetivos del trabajo fueron obtener fracciones peptidicas a partir de la semilla de A. hypochondriacus y
evaluar su efecto inmunomodulador haciendo uso de cultivo de celulas intestinales Caco-2 ccl20:luc.
Ademas se identificaron y sintetizaron los peptidos responsables de la modulacion. Se evaluo el efecto
inmunomodulador de un aislado proteico de A. hypochondriacus y de dos hidrolizados del mismo por
accion de alcalasa con 23% y 30% grado de hidrolisis (GH), a diferentes concentraciones. Se utilizaron
celulas epiteliales de colon humano transfectadas con el gen reportero luciferasa bajo el control del
promotor ccl20 (Caco-2 ccl20:luc) altamente inducible por el estimulo pro-inflamatorio del Toll-Like
Receptor 5 (cuyo agonista es flagelina (FliC)), siendo un indicador sensible de la respuesta inmune innata.
Las celulas Caco-2 ccl20:luc fueron incubadas con aislado e hidrolizados a diferentes concentraciones, y
estimuladas en forma conjunta con FliC por 4 h. Los resultados mostraron una actividad inhibitoria que
aumento con la concentracion (comportamiento dosis-respuesta) y con el GH. La muestra mas activa (30%
GH) fue ensayada en experiencias de preincubacion con las celulas, a diferentes concentraciones, se
incubo durante 1 y 2 h, luego se lavo con PBS y a continuacion se activo con FliC por 4 h. Estos
resultados mostraron que la inhibicion de la actividad luciferasa es perdurable en el tiempo, aun sin estar
en contacto simultaneo con FliC, por lo que estos peptidos tendrian efecto preventivo en la induccion
del proceso inflamatorio (efecto tiempo-respuesta). Los hidrolizados de 23% y 30% GH fueron analizados y
fraccionados mediante RP-HPLC; en ambos casos varias de las fracciones obtenidas presentaron
actividad inhibitoria con un comportamiento dosis-respuesta. Las fracciones de menor tiempo de retencion
presentaron mayor actividad, las provenientes del hidrolizado 30% GH fueron las mas inhibitorias. Las
dos fracciones mas activas de este hidrolizado fueron subfraccionadas en RP-HPLC obteniendose en
cada caso 15 picos, los que fueron aislados y ensayada su actividad. De las muestras que presentaron un
efecto inhibitorio importante (8 en total) se eligieron 5 para su secuenciacion mediante la combinacion
de Nano-cromatografia (RSLC 3000) con espectrometria de masa (ESI-ORBITRAP Velos). Se
identificaron 15 peptidos. A traves de ensayos in sílico con el uso del programa EMBOSS, tomando como
base de datos las secuencias con actividad inmunomoduladora provenientes de BIOPEP, los 15
peptidos se alinearon en 9 grupos. Se procedio luego a la obtencion de secuencias consenso utilizando el
programa CLUSTALW. En base al estudio de los peptidos secuenciados mas los consenso, se
seleccionaron 4 para su sintesis por Sintesis Peptidica en Fase Solida. Se obtuvieron fracciones
polipeptidicas que presentan actividad inmunomodulatoria in vitro, en modelos dosis-respuesta y tiemporespuesta.
Se identificaron y sintetizaron los peptidos provenientes de las fracciones mas activas, para
continuar luego con ensayos in vitro por Real-time qPCR e in vivo en ratones Balb/c, a efectos de
profundizar en el mecanismo de accion de dichos peptidos.hypochondriacus y
evaluar su efecto inmunomodulador haciendo uso de cultivo de celulas intestinales Caco-2 ccl20:luc.
Ademas se identificaron y sintetizaron los peptidos responsables de la modulacion. Se evaluo el efecto
inmunomodulador de un aislado proteico de A. hypochondriacus y de dos hidrolizados del mismo por
accion de alcalasa con 23% y 30% grado de hidrolisis (GH), a diferentes concentraciones. Se utilizaron
celulas epiteliales de colon humano transfectadas con el gen reportero luciferasa bajo el control del
promotor ccl20 (Caco-2 ccl20:luc) altamente inducible por el estimulo pro-inflamatorio del Toll-Like
Receptor 5 (cuyo agonista es flagelina (FliC)), siendo un indicador sensible de la respuesta inmune innata.
Las celulas Caco-2 ccl20:luc fueron incubadas con aislado e hidrolizados a diferentes concentraciones, y
estimuladas en forma conjunta con FliC por 4 h. Los resultados mostraron una actividad inhibitoria que
aumento con la concentracion (comportamiento dosis-respuesta) y con el GH. La muestra mas activa (30%
GH) fue ensayada en experiencias de preincubacion con las celulas, a diferentes concentraciones, se
incubo durante 1 y 2 h, luego se lavo con PBS y a continuacion se activo con FliC por 4 h. Estos
resultados mostraron que la inhibicion de la actividad luciferasa es perdurable en el tiempo, aun sin estar
en contacto simultaneo con FliC, por lo que estos peptidos tendrian efecto preventivo en la induccion
del proceso inflamatorio (efecto tiempo-respuesta). Los hidrolizados de 23% y 30% GH fueron analizados y
fraccionados mediante RP-HPLC; en ambos casos varias de las fracciones obtenidas presentaron
actividad inhibitoria con un comportamiento dosis-respuesta. Las fracciones de menor tiempo de retencion
presentaron mayor actividad, las provenientes del hidrolizado 30% GH fueron las mas inhibitorias. Las
dos fracciones mas activas de este hidrolizado fueron subfraccionadas en RP-HPLC obteniendose en
cada caso 15 picos, los que fueron aislados y ensayada su actividad. De las muestras que presentaron un
efecto inhibitorio importante (8 en total) se eligieron 5 para su secuenciacion mediante la combinacion
de Nano-cromatografia (RSLC 3000) con espectrometria de masa (ESI-ORBITRAP Velos). Se
identificaron 15 peptidos. A traves de ensayos in sílico con el uso del programa EMBOSS, tomando como
base de datos las secuencias con actividad inmunomoduladora provenientes de BIOPEP, los 15
peptidos se alinearon en 9 grupos. Se procedio luego a la obtencion de secuencias consenso utilizando el
programa CLUSTALW. En base al estudio de los peptidos secuenciados mas los consenso, se
seleccionaron 4 para su sintesis por Sintesis Peptidica en Fase Solida. Se obtuvieron fracciones
polipeptidicas que presentan actividad inmunomodulatoria in vitro, en modelos dosis-respuesta y tiemporespuesta.
Se identificaron y sintetizaron los peptidos provenientes de las fracciones mas activas, para
continuar luego con ensayos in vitro por Real-time qPCR e in vivo en ratones Balb/c, a efectos de
profundizar en el mecanismo de accion de dichos peptidos.A. hypochondriacus y de dos hidrolizados del mismo por
accion de alcalasa con 23% y 30% grado de hidrolisis (GH), a diferentes concentraciones. Se utilizaron
celulas epiteliales de colon humano transfectadas con el gen reportero luciferasa bajo el control del
promotor ccl20 (Caco-2 ccl20:luc) altamente inducible por el estimulo pro-inflamatorio del Toll-Like
Receptor 5 (cuyo agonista es flagelina (FliC)), siendo un indicador sensible de la respuesta inmune innata.
Las celulas Caco-2 ccl20:luc fueron incubadas con aislado e hidrolizados a diferentes concentraciones, y
estimuladas en forma conjunta con FliC por 4 h. Los resultados mostraron una actividad inhibitoria que
aumento con la concentracion (comportamiento dosis-respuesta) y con el GH. La muestra mas activa (30%
GH) fue ensayada en experiencias de preincubacion con las celulas, a diferentes concentraciones, se
incubo durante 1 y 2 h, luego se lavo con PBS y a continuacion se activo con FliC por 4 h. Estos
resultados mostraron que la inhibicion de la actividad luciferasa es perdurable en el tiempo, aun sin estar
en contacto simultaneo con FliC, por lo que estos peptidos tendrian efecto preventivo en la induccion
del proceso inflamatorio (efecto tiempo-respuesta). Los hidrolizados de 23% y 30% GH fueron analizados y
fraccionados mediante RP-HPLC; en ambos casos varias de las fracciones obtenidas presentaron
actividad inhibitoria con un comportamiento dosis-respuesta. Las fracciones de menor tiempo de retencion
presentaron mayor actividad, las provenientes del hidrolizado 30% GH fueron las mas inhibitorias. Las
dos fracciones mas activas de este hidrolizado fueron subfraccionadas en RP-HPLC obteniendose en
cada caso 15 picos, los que fueron aislados y ensayada su actividad. De las muestras que presentaron un
efecto inhibitorio importante (8 en total) se eligieron 5 para su secuenciacion mediante la combinacion
de Nano-cromatografia (RSLC 3000) con espectrometria de masa (ESI-ORBITRAP Velos). Se
identificaron 15 peptidos. A traves de ensayos in sílico con el uso del programa EMBOSS, tomando como
base de datos las secuencias con actividad inmunomoduladora provenientes de BIOPEP, los 15
peptidos se alinearon en 9 grupos. Se procedio luego a la obtencion de secuencias consenso utilizando el
programa CLUSTALW. En base al estudio de los peptidos secuenciados mas los consenso, se
seleccionaron 4 para su sintesis por Sintesis Peptidica en Fase Solida. Se obtuvieron fracciones
polipeptidicas que presentan actividad inmunomodulatoria in vitro, en modelos dosis-respuesta y tiemporespuesta.
Se identificaron y sintetizaron los peptidos provenientes de las fracciones mas activas, para
continuar luego con ensayos in vitro por Real-time qPCR e in vivo en ratones Balb/c, a efectos de
profundizar en el mecanismo de accion de dichos peptidos.Toll-Like
Receptor 5 (cuyo agonista es flagelina (FliC)), siendo un indicador sensible de la respuesta inmune innata.
Las celulas Caco-2 ccl20:luc fueron incubadas con aislado e hidrolizados a diferentes concentraciones, y
estimuladas en forma conjunta con FliC por 4 h. Los resultados mostraron una actividad inhibitoria que
aumento con la concentracion (comportamiento dosis-respuesta) y con el GH. La muestra mas activa (30%
GH) fue ensayada en experiencias de preincubacion con las celulas, a diferentes concentraciones, se
incubo durante 1 y 2 h, luego se lavo con PBS y a continuacion se activo con FliC por 4 h. Estos
resultados mostraron que la inhibicion de la actividad luciferasa es perdurable en el tiempo, aun sin estar
en contacto simultaneo con FliC, por lo que estos peptidos tendrian efecto preventivo en la induccion
del proceso inflamatorio (efecto tiempo-respuesta). Los hidrolizados de 23% y 30% GH fueron analizados y
fraccionados mediante RP-HPLC; en ambos casos varias de las fracciones obtenidas presentaron
actividad inhibitoria con un comportamiento dosis-respuesta. Las fracciones de menor tiempo de retencion
presentaron mayor actividad, las provenientes del hidrolizado 30% GH fueron las mas inhibitorias. Las
dos fracciones mas activas de este hidrolizado fueron subfraccionadas en RP-HPLC obteniendose en
cada caso 15 picos, los que fueron aislados y ensayada su actividad. De las muestras que presentaron un
efecto inhibitorio importante (8 en total) se eligieron 5 para su secuenciacion mediante la combinacion
de Nano-cromatografia (RSLC 3000) con espectrometria de masa (ESI-ORBITRAP Velos). Se
identificaron 15 peptidos. A traves de ensayos in sílico con el uso del programa EMBOSS, tomando como
base de datos las secuencias con actividad inmunomoduladora provenientes de BIOPEP, los 15
peptidos se alinearon en 9 grupos. Se procedio luego a la obtencion de secuencias consenso utilizando el
programa CLUSTALW. En base al estudio de los peptidos secuenciados mas los consenso, se
seleccionaron 4 para su sintesis por Sintesis Peptidica en Fase Solida. Se obtuvieron fracciones
polipeptidicas que presentan actividad inmunomodulatoria in vitro, en modelos dosis-respuesta y tiemporespuesta.
Se identificaron y sintetizaron los peptidos provenientes de las fracciones mas activas, para
continuar luego con ensayos in vitro por Real-time qPCR e in vivo en ratones Balb/c, a efectos de
profundizar en el mecanismo de accion de dichos peptidos.(cuyo agonista es flagelina (FliC)), siendo un indicador sensible de la respuesta inmune innata.
Las celulas Caco-2 ccl20:luc fueron incubadas con aislado e hidrolizados a diferentes concentraciones, y
estimuladas en forma conjunta con FliC por 4 h. Los resultados mostraron una actividad inhibitoria que
aumento con la concentracion (comportamiento dosis-respuesta) y con el GH. La muestra mas activa (30%
GH) fue ensayada en experiencias de preincubacion con las celulas, a diferentes concentraciones, se
incubo durante 1 y 2 h, luego se lavo con PBS y a continuacion se activo con FliC por 4 h. Estos
resultados mostraron que la inhibicion de la actividad luciferasa es perdurable en el tiempo, aun sin estar
en contacto simultaneo con FliC, por lo que estos peptidos tendrian efecto preventivo en la induccion
del proceso inflamatorio (efecto tiempo-respuesta). Los hidrolizados de 23% y 30% GH fueron analizados y
fraccionados mediante RP-HPLC; en ambos casos varias de las fracciones obtenidas presentaron
actividad inhibitoria con un comportamiento dosis-respuesta. Las fracciones de menor tiempo de retencion
presentaron mayor actividad, las provenientes del hidrolizado 30% GH fueron las mas inhibitorias. Las
dos fracciones mas activas de este hidrolizado fueron subfraccionadas en RP-HPLC obteniendose en
cada caso 15 picos, los que fueron aislados y ensayada su actividad. De las muestras que presentaron un
efecto inhibitorio importante (8 en total) se eligieron 5 para su secuenciacion mediante la combinacion
de Nano-cromatografia (RSLC 3000) con espectrometria de masa (ESI-ORBITRAP Velos). Se
identificaron 15 peptidos. A traves de ensayos in sílico con el uso del programa EMBOSS, tomando como
base de datos las secuencias con actividad inmunomoduladora provenientes de BIOPEP, los 15
peptidos se alinearon en 9 grupos. Se procedio luego a la obtencion de secuencias consenso utilizando el
programa CLUSTALW. En base al estudio de los peptidos secuenciados mas los consenso, se
seleccionaron 4 para su sintesis por Sintesis Peptidica en Fase Solida. Se obtuvieron fracciones
polipeptidicas que presentan actividad inmunomodulatoria in vitro, en modelos dosis-respuesta y tiemporespuesta.
Se identificaron y sintetizaron los peptidos provenientes de las fracciones mas activas, para
continuar luego con ensayos in vitro por Real-time qPCR e in vivo en ratones Balb/c, a efectos de
profundizar en el mecanismo de accion de dichos peptidos.dosis-respuesta) y con el GH. La muestra mas activa (30%
GH) fue ensayada en experiencias de preincubacion con las celulas, a diferentes concentraciones, se
incubo durante 1 y 2 h, luego se lavo con PBS y a continuacion se activo con FliC por 4 h. Estos
resultados mostraron que la inhibicion de la actividad luciferasa es perdurable en el tiempo, aun sin estar
en contacto simultaneo con FliC, por lo que estos peptidos tendrian efecto preventivo en la induccion
del proceso inflamatorio (efecto tiempo-respuesta). Los hidrolizados de 23% y 30% GH fueron analizados y
fraccionados mediante RP-HPLC; en ambos casos varias de las fracciones obtenidas presentaron
actividad inhibitoria con un comportamiento dosis-respuesta. Las fracciones de menor tiempo de retencion
presentaron mayor actividad, las provenientes del hidrolizado 30% GH fueron las mas inhibitorias. Las
dos fracciones mas activas de este hidrolizado fueron subfraccionadas en RP-HPLC obteniendose en
cada caso 15 picos, los que fueron aislados y ensayada su actividad. De las muestras que presentaron un
efecto inhibitorio importante (8 en total) se eligieron 5 para su secuenciacion mediante la combinacion
de Nano-cromatografia (RSLC 3000) con espectrometria de masa (ESI-ORBITRAP Velos). Se
identificaron 15 peptidos. A traves de ensayos in sílico con el uso del programa EMBOSS, tomando como
base de datos las secuencias con actividad inmunomoduladora provenientes de BIOPEP, los 15
peptidos se alinearon en 9 grupos. Se procedio luego a la obtencion de secuencias consenso utilizando el
programa CLUSTALW. En base al estudio de los peptidos secuenciados mas los consenso, se
seleccionaron 4 para su sintesis por Sintesis Peptidica en Fase Solida. Se obtuvieron fracciones
polipeptidicas que presentan actividad inmunomodulatoria in vitro, en modelos dosis-respuesta y tiemporespuesta.
Se identificaron y sintetizaron los peptidos provenientes de las fracciones mas activas, para
continuar luego con ensayos in vitro por Real-time qPCR e in vivo en ratones Balb/c, a efectos de
profundizar en el mecanismo de accion de dichos peptidos.tiempo-respuesta). Los hidrolizados de 23% y 30% GH fueron analizados y
fraccionados mediante RP-HPLC; en ambos casos varias de las fracciones obtenidas presentaron
actividad inhibitoria con un comportamiento dosis-respuesta. Las fracciones de menor tiempo de retencion
presentaron mayor actividad, las provenientes del hidrolizado 30% GH fueron las mas inhibitorias. Las
dos fracciones mas activas de este hidrolizado fueron subfraccionadas en RP-HPLC obteniendose en
cada caso 15 picos, los que fueron aislados y ensayada su actividad. De las muestras que presentaron un
efecto inhibitorio importante (8 en total) se eligieron 5 para su secuenciacion mediante la combinacion
de Nano-cromatografia (RSLC 3000) con espectrometria de masa (ESI-ORBITRAP Velos). Se
identificaron 15 peptidos. A traves de ensayos in sílico con el uso del programa EMBOSS, tomando como
base de datos las secuencias con actividad inmunomoduladora provenientes de BIOPEP, los 15
peptidos se alinearon en 9 grupos. Se procedio luego a la obtencion de secuencias consenso utilizando el
programa CLUSTALW. En base al estudio de los peptidos secuenciados mas los consenso, se
seleccionaron 4 para su sintesis por Sintesis Peptidica en Fase Solida. Se obtuvieron fracciones
polipeptidicas que presentan actividad inmunomodulatoria in vitro, en modelos dosis-respuesta y tiemporespuesta.
Se identificaron y sintetizaron los peptidos provenientes de las fracciones mas activas, para
continuar luego con ensayos in vitro por Real-time qPCR e in vivo en ratones Balb/c, a efectos de
profundizar en el mecanismo de accion de dichos peptidos.dosis-respuesta. Las fracciones de menor tiempo de retencion
presentaron mayor actividad, las provenientes del hidrolizado 30% GH fueron las mas inhibitorias. Las
dos fracciones mas activas de este hidrolizado fueron subfraccionadas en RP-HPLC obteniendose en
cada caso 15 picos, los que fueron aislados y ensayada su actividad. De las muestras que presentaron un
efecto inhibitorio importante (8 en total) se eligieron 5 para su secuenciacion mediante la combinacion
de Nano-cromatografia (RSLC 3000) con espectrometria de masa (ESI-ORBITRAP Velos). Se
identificaron 15 peptidos. A traves de ensayos in sílico con el uso del programa EMBOSS, tomando como
base de datos las secuencias con actividad inmunomoduladora provenientes de BIOPEP, los 15
peptidos se alinearon en 9 grupos. Se procedio luego a la obtencion de secuencias consenso utilizando el
programa CLUSTALW. En base al estudio de los peptidos secuenciados mas los consenso, se
seleccionaron 4 para su sintesis por Sintesis Peptidica en Fase Solida. Se obtuvieron fracciones
polipeptidicas que presentan actividad inmunomodulatoria in vitro, en modelos dosis-respuesta y tiemporespuesta.
Se identificaron y sintetizaron los peptidos provenientes de las fracciones mas activas, para
continuar luego con ensayos in vitro por Real-time qPCR e in vivo en ratones Balb/c, a efectos de
profundizar en el mecanismo de accion de dichos peptidos.in sílico con el uso del programa EMBOSS, tomando como
base de datos las secuencias con actividad inmunomoduladora provenientes de BIOPEP, los 15
peptidos se alinearon en 9 grupos. Se procedio luego a la obtencion de secuencias consenso utilizando el
programa CLUSTALW. En base al estudio de los peptidos secuenciados mas los consenso, se
seleccionaron 4 para su sintesis por Sintesis Peptidica en Fase Solida. Se obtuvieron fracciones
polipeptidicas que presentan actividad inmunomodulatoria in vitro, en modelos dosis-respuesta y tiemporespuesta.
Se identificaron y sintetizaron los peptidos provenientes de las fracciones mas activas, para
continuar luego con ensayos in vitro por Real-time qPCR e in vivo en ratones Balb/c, a efectos de
profundizar en el mecanismo de accion de dichos peptidos.. Se obtuvieron fracciones
polipeptidicas que presentan actividad inmunomodulatoria in vitro, en modelos dosis-respuesta y tiemporespuesta.
Se identificaron y sintetizaron los peptidos provenientes de las fracciones mas activas, para
continuar luego con ensayos in vitro por Real-time qPCR e in vivo en ratones Balb/c, a efectos de
profundizar en el mecanismo de accion de dichos peptidos.in vitro, en modelos dosis-respuesta y tiemporespuesta.
Se identificaron y sintetizaron los peptidos provenientes de las fracciones mas activas, para
continuar luego con ensayos in vitro por Real-time qPCR e in vivo en ratones Balb/c, a efectos de
profundizar en el mecanismo de accion de dichos peptidos.in vitro por Real-time qPCR e in vivo en ratones Balb/c, a efectos de
profundizar en el mecanismo de accion de dichos peptidos.