Actividad inmunomoduladora de péptidos de Amaranthus hypochondriacus

MORONTA JULIAN; DOCENA G; AÑON MARIA CRISTINA

Congreso; IV Congreso Internacional Ciencia y Tecnología de los alimentos; 2012

Los objetivos del trabajo fueron obtener fracciones peptidicas a partir de la semilla de A. hypochondriacus y evaluar su efecto inmunomodulador haciendo uso de cultivo de celulas intestinales Caco-2 ccl20:luc. Ademas se identificaron y sintetizaron los peptidos responsables de la modulacion. Se evaluo el efecto inmunomodulador de un aislado proteico de A. hypochondriacus y de dos hidrolizados del mismo por accion de alcalasa con 23% y 30% grado de hidrolisis (GH), a diferentes concentraciones. Se utilizaron celulas epiteliales de colon humano transfectadas con el gen reportero luciferasa bajo el control del promotor ccl20 (Caco-2 ccl20:luc) altamente inducible por el estimulo pro-inflamatorio del Toll-Like Receptor 5 (cuyo agonista es flagelina (FliC)), siendo un indicador sensible de la respuesta inmune innata. Las celulas Caco-2 ccl20:luc fueron incubadas con aislado e hidrolizados a diferentes concentraciones, y estimuladas en forma conjunta con FliC por 4 h. Los resultados mostraron una actividad inhibitoria que aumento con la concentracion (comportamiento dosis-respuesta) y con el GH. La muestra mas activa (30% GH) fue ensayada en experiencias de preincubacion con las celulas, a diferentes concentraciones, se incubo durante 1 y 2 h, luego se lavo con PBS y a continuacion se activo con FliC por 4 h. Estos resultados mostraron que la inhibicion de la actividad luciferasa es perdurable en el tiempo, aun sin estar en contacto simultaneo con FliC, por lo que estos peptidos tendrian efecto preventivo en la inducción del proceso inflamatorio (efecto tiempo-respuesta). Los hidrolizados de 23% y 30% GH fueron analizados y fraccionados mediante RP-HPLC; en ambos casos varias de las fracciones obtenidas presentaron actividad inhibitoria con un comportamiento dosis-respuesta. Las fracciones de menor tiempo de retención presentaron mayor actividad, las provenientes del hidrolizado 30% GH fueron las mas inhibitorias. Las dos fracciones mas activas de este hidrolizado fueron subfraccionadas en RP-HPLC obteniendose en cada caso 15 picos, los que fueron aislados y ensayada su actividad. De las muestras que presentaron un efecto inhibitorio importante (8 en total) se eligieron 5 para su secuenciacion mediante la combinación de Nano-cromatografia (RSLC 3000) con espectrometria de masa (ESI-ORBITRAP Velos). Se identificaron 15 peptidos. A traves de ensayos in sílico con el uso del programa EMBOSS, tomando como base de datos las secuencias con actividad inmunomoduladora provenientes de BIOPEP, los 15 peptidos se alinearon en 9 grupos. Se procedio luego a la obtencion de secuencias consenso utilizando el programa CLUSTALW. En base al estudio de los peptidos secuenciados mas los consenso, se seleccionaron 4 para su sintesis por Sintesis Peptidica en Fase Solida. Se obtuvieron fracciones polipeptidicas que presentan actividad inmunomodulatoria in vitro, en modelos dosis-respuesta y tiempo respuesta. Se identificaron y sintetizaron los peptidos provenientes de las fracciones mas activas, para continuar luego con ensayos in vitro por Real-time qPCR e in vivo en ratones Balb/c, a efectos de profundizar en el mecanismo de accion de dichos